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纯钛表面不同处理对人牙龈成纤维细胞增殖的影响

刘潇  
【摘要】:目的:种植体颈部软组织附着形成的“袖口”结构,可以形成良好的生物封闭屏障,有效阻止细菌及其他致炎因子的入侵,减少种植术后骨吸收,是维持种植体长期稳定性的重要因素之一。合理的种植体颈部处理应该有利于种植体颈部牙龈附着-袖口的形成。本实验旨在通过比较三种不同处理方法纯钛表面对体外培养的人牙龈成纤维细胞粘附及增殖的影响,探讨更有利于人牙龈成纤维附着的种植体颈部表面处理方法,为临床种植体颈部改良设计的提供有力的实验依据。 方法: 1纯钛片的制备与分组 制备直径10mm、厚度1mm,Ra0.8μm的纯钛钛片24枚,分为3组,每组8枚。 A组(TiO_2颗粒喷砂+HCl/H_2SO_4双重酸蚀组):80目TiO_2砂粒在5Kpa气压下均匀喷到纯钛钛片表面进行表面粗化,HCl/H_2SO_4双重酸蚀处理。 B组(Al_2O_3颗粒喷砂+HCl/H_2SO_4双重酸蚀组):80目Al_2O_3砂粒在5Kpa气压下均匀喷到纯钛钛片表面进行表面粗化,HCl/H_2SO_4双重酸蚀处理。 C组(光滑组):钛片表面不做任何处理。2不同处理纯钛表面形貌的扫描电镜观察清洗干净、高温消毒后的每组钛片1枚,扫描电子显微镜观察钛片表面形貌。 3人牙龈成纤维细胞的培养与鉴定 取临床阻生齿拔除术切除的牙龈组织,要求为无炎症、无增生的健康牙龈,患者年龄在18-25岁。采用组织块贴壁法进行人牙龈成纤维细胞的原代培养,通过反复贴壁法去除原代培养中混杂的上皮样细胞,得到纯化人牙龈成纤维细胞。HE染色观察纯化后第4代人牙龈成纤维细胞的形态;应用波形蛋白(Vimentin)、角蛋白(CKs)及α横纹肌肌动蛋白(α-Actin)的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。 4不同处理纯钛表面人牙龈成纤维细胞的培养 取第4代生长良好的人牙龈成纤维细胞,制备成细胞浓度为4.0×105个/ml的单细胞悬液,分别接种于三组不同处理的纯钛表面以及作为对照的玻片表面进行培养。培养24小时后,取各组纯钛片进行MTT检测,培养3天后进行扫描电镜观察。 5不同处理纯钛表面人牙龈成纤维细胞的形态及分布扫描电镜观察 培养三天后经扫描电子显微镜(scanning electronmicroscopy, SEM)观察不同处理纯钛表面人牙龈成纤维细胞的形态及分布。 6不同处理纯钛表面人牙龈成纤维细胞增殖活性MTT检测 培养24小时后应用MTT法测量三组(每组6枚)不同处理纯钛表面的吸光度值,计算各组吸光度均值(以x±SD表示)进行统计学分析。 7统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件,若实验数据满足正态分布及方差齐性应用单因素方差分析进行检验,P0.05表示有统计学意义,并应用SNK进行组间的两两比较。若不满足正态分布或方差齐性则应用多个独立样本比较的K-WH检验,P0.05表示具有统计学意义,并且采用Wilcoxon秩和检验进行组间的两两比较。 结果: 1不同处理纯钛表面形貌的扫描电镜观察结果TiO_2颗粒喷砂双重酸洗处理与Al_2O_3颗粒喷砂双重酸蚀处理的纯钛表面形貌相似,均形成大小不一,凹凸不平的一级窝洞及二级窝洞,窝洞边缘较为圆钝。未经处理的纯钛表面相对光滑,可见蜂窝状浅表窝洞。 2人牙龈成纤维细胞的鉴定 倒置显微镜下观察原代细胞以组织块为中心呈放射状排列生长,细胞呈长梭形或多角形,胞体丰满,胞浆均匀透明,核仁清晰。传代细胞生长旺盛,与原代形态相同。HE染色显示细胞呈长梭形或多角形,椭圆形胞核位于细胞中央,内含2-3个核仁。细胞免疫细胞化学染色结果显示细胞抗波形蛋白染色呈强阳性,胞浆棕褐色;抗角蛋白染色阴性及抗α横纹肌肌动蛋白染色阴性,胞浆阴性,胞核染成蓝色。证明细胞来源于中胚层,且非上皮源性及肌源性细胞,符合成纤维细胞样细胞的特征,体外成功培养人牙龈成纤维细胞。 3不同处理纯钛表面人牙龈成纤维细胞的形态及分布扫描电镜观察喷砂粗化双重酸蚀处理的两组纯钛表面细胞较表面不做处理的光滑钛片表面细胞更为密集。喷砂粗化双重酸蚀处理的两组纯钛表面细胞胞体丰满,伸展良好,伸出伪足多而长,伸入周边凹孔内,细胞固定牢固,有的细胞之间伪足可交织成网状,粗糙表面布满细胞外基质。而表面不作处理光滑组纯钛表面附着的细胞较粗糙的两组伸展较差,有的细胞近似圆形,伪足少且较短,细胞外基质分泌较少。在光滑的玻片上细胞扁平,呈长梭形,可见细丝状伪足伸展。 4不同处理纯钛表面人牙龈成纤维细胞生长活性MTT检测培养24小时各组吸光度均值(以x±SD表示),A组(TiO_2颗粒喷砂+HCl/H_2SO_4双重酸蚀组)为1.122±0.026,B组(Al_2O_3颗粒喷砂+HCl/H_2SO_4双重酸蚀组)为0.772±0.079,C组(表面不做处理的光滑组)为0.305±0.035。采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析,P0.05,有统计学意义。SNK检验进行组间的两两比较,A组与B组,A组与C组,B组与C组之间均有差异。 结论: 1三种不同表面处理的纯钛片都具有良好的生物学性能,人牙龈成纤维细胞均可良好生长。 2喷砂粗化双重酸蚀表面处理的纯钛表面有利于人牙龈成纤维细胞的粘附生长,TiO_2喷砂双重酸蚀处理的纯钛表面优于Al_2O_3喷砂双重酸蚀处理的纯钛表面。


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