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纯钛表面不同处理对成骨细胞生长的影响

么远  
【摘要】:目的:纯钛及钛合金具有良好生物相容性。通过对种植体表面的不同处理能改进种植体表面的形貌及结构,可增强表面生物学活性,促进种植体骨结合的形成。成骨细胞的生长活性及生物学功能、种植材料的表面特性(主要包括表面粗糙度及表面形貌、表面亲水性、表面化学成分等)、种植体应力环境等都可能影响种植体的骨整合。喷砂酸蚀的表面优化处理方法能增强种植体表面粗糙度,一方面可能加强种植体与周围骨组织的接触面积和接触方式,另一方面可能增强成骨细胞的生物学活性,有利于种植体骨整合的形成。成骨细胞是种植体周围骨组织形成的重要细胞。本研究采用TiO_2砂粒喷砂HCl/H_2SO_4混合液酸蚀、Al_2O_3砂粒喷砂HCl/H_2SO_4混合液酸蚀和未处理光滑三种纯钛片,通过SD大鼠成骨细胞的体外培养与鉴定、扫描电镜SEM观察成骨细胞在各种钛片表面伸展形态及MTT法测定细胞增殖活性等,为种植体的优化表面处理提供实验依据。 方法: 1钛片的制备及分组制备直径10mm,厚度1mm的纯钛钛片24枚,Ra=0.8μm,分3组,每组8枚。 A组TiO_2砂粒喷砂HCl/H_2SO_4酸蚀组:80目TiO_2砂粒,5Kpa气压下喷砂;用浓HCl/H_2SO_4混合液于常温下酸蚀40分钟。 B组Al_2O_3砂粒喷砂HCl/H_2SO_4酸蚀组:80目TiO_2砂粒,5Kpa气压下喷砂;用浓HCl/H_2SO_4混合液于常温下酸蚀40分钟。 C组光滑组:表面不做任何处理。 2三种不同处理纯钛表面形貌的扫描电镜观察 采用扫描电镜观察TiO_2砂粒喷砂酸蚀钛片、Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀钛片和光滑钛片表面形貌。 3成骨细胞分离、培养、传代与鉴定 取新生24h SD乳鼠颅盖骨,剪成1×1mm碎骨片,用“二次酶消化法”和“速差贴壁法”分离获得原代成骨细胞。观察细胞长满瓶底,用0.25%胰酶消化传代。采用第二代成骨细胞的细胞爬片进行HE染色和BMP-II免疫细胞化学染色,进行成骨细胞鉴定。 4不同处理纯钛表面成骨细胞的培养 取生长良好的第2代细胞,制备成细胞浓度为8×10~5个/ml的单细胞悬液,分别接种于TiO_2砂粒喷砂酸蚀表面、Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀表面、机械光滑钛片和对照组玻片4种表面,三组钛片和玻片分别放入24孔培养板内,细胞与钛片联合培养3d后分别进行扫描电镜观察及MTT法细胞活性检测。 5 TiO_2砂粒喷砂酸蚀钛片、Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀钛片、光滑钛片和玻片表面成骨细胞形态的扫描电镜观察 取生长良好的第2代细胞,制备成细胞浓度为8×10~5个/ml的单细胞悬液,分别接种于A组,B组和C组钛片和对照组玻片4种表面,在24孔培养板内细胞与钛片联合培养3d后,采用扫描电镜观察四组表面细胞形态。 6钛片表面成骨细胞MTT法细胞活性的测定 TiO_2砂粒喷砂酸蚀,Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀,光滑钛片三组试样经高温高压消毒分别放入24孔培养板内,每组设6个平行试样,将第2代SD大鼠成骨细胞悬液接种于三组钛片表面(接种密度为7×104个/孔),细胞与钛片联合培养3d后,用酶联免疫仪在490nm处测定各组钛片表面的吸光度值。 7统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件,应用单因素方差分析比较三组间吸光度值,并采用SNK法进行组间两两比较,P0.05表明结果有统计学差异。 结果: 1三种不同处理纯钛表面形貌的扫描电镜观察结果 TiO_2砂粒喷砂酸蚀钛片表面和Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀钛片表面均形成大小不一的一级窝洞及二级窝洞,两种表面形成的洞形相似,光滑表面则形成浅显的窝洞形态。 2成骨细胞的鉴定 原代细胞呈现成纤维细胞样外观,为不规则梭形或多角形。传代细胞形态与原代相似,可出现重叠生长的现象。 HE染色观察:胞核蓝染,胞浆红染。细胞形态为不规则的梭形或多角形。胞核呈卵圆形,可见1~3个核仁。 BMP-II免疫细胞化学染色观察:镜下各视野中大多数为胞核周围的胞浆中呈棕黄或棕褐色着色的阳性细胞。 经原代及传代细胞的形态学观察、HE染色及BMP-II免疫细胞化学染色,鉴定细胞为成骨细胞。 3 TiO_2砂粒喷砂酸蚀钛片、Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀钛片、光滑钛片和玻片表面成骨细胞形态的扫描电镜观察结果 TiO_2砂粒喷砂酸蚀钛片、Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀钛片、光滑三组钛片表面的成骨细胞均形成重叠生长的细胞层,玻片上的细胞呈单个生长,细胞在A,B,C三组钛片表面的生长数量明显多于玻片表面。 A组和B组的细胞层厚度大于C组;A组和B组钛片表面成骨细胞伪足或突起嵌入窝洞或二级窝洞中。 4三组钛片表面成骨细胞增殖活性检测 成骨细胞在各组钛片表面培养3d后的吸光度值比较:TiO_2砂粒喷砂酸蚀组吸光度值:0.380±0.018、Al_2O_3砂粒喷砂酸蚀组吸光度值:0.328±0.009、光滑组吸光度值:0.279±0.013,三组钛片表面成骨细胞吸光度值之间均有统计学差异(P0.05)。 结论: 1 TiO_2砂粒喷砂双重酸蚀、Al_2O_3砂粒喷砂双重酸蚀与光滑三种不同处理的纯钛表面均具有良好的生物学性能,成骨细胞在三种表面均能良好生长; 2 TiO_2砂粒喷砂双重酸蚀、Al_2O_3砂粒喷砂双重酸蚀两种表面处理的纯钛表面有利于成骨细胞生长;TiO_2砂粒喷砂双重酸蚀表面处理的纯钛表面更有利于成骨细胞生长。


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