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肠道微生态环境与儿童过敏性疾病的关系以及参芪健脾方对肠粘膜屏障功能修复和免疫功能调整的研究

张琳  
【摘要】:在过去20年里,大量研究证实世界范围内过敏性疾病的发病率逐年增加,其原因不十分清楚。“卫生假说”为儿童在生命早期缺乏微生物的暴露导致今后过敏性疾病的发生进行了解释,由于缺乏微生物刺激导致Th1/Th2平衡紊乱和调节性T细胞功能低下。越来越多研究认为,儿童早期缺乏微生物接触导致的过敏与今后发生哮喘和过敏性疾病的风险密切相关。虽然过敏和哮喘具有遗传倾向性,但基因与环境的相互作用更能解释发病机制。环境因素如感染、接触过敏原以及产前因素如母亲吸烟、孕期营养、产妇精神压力、分娩方式和新生儿期应用抗生素等均会影响小儿今后过敏性疾病和支气管哮喘的发生。通过基因与环境的相互作用、表观遗传学以及分子生物学深入研究,力图解开假定风险与过敏性疾病和支气管哮喘发生的关联。有关哮喘和过敏性紫癜的流行病学资料、危险因素调查以及病理机制有待进一步解释,了解这些机理对减少哮喘发生风险及寻找切实有效的药物干预微生态生境,调整免疫功能对过敏性疾病的预防是十分必要的。 第一部分:肠道微生态学变化、CD4+T细胞亚群及相应转录因子在儿童支气管哮喘病理机制中的调控作用 目的:探讨肠道微生态环境变化以及免疫网络结构中CD4+T亚群及相应细胞因子和上游转录因子在支气管哮喘病理机制中的相互调控作用。 方法:采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对47例支气管哮喘患儿和32例健康对照组儿童外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell , PBMC )测定CD3+CD8-INF-γ+ IL-4- ( Th1 )、CD3+CD8-INF-γ- IL-4(+Th2)、CD4+CD25+T细胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+( Th17)细胞百分比;采用酶联免疫吸附试验( Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血浆中细胞因子INF-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17水平;T-bet是调控Th1细胞分化、GATA3是调控Th2细胞分化、Foxp3是调控调节性T细胞分化、ROR-γt是Th17分化的关键性转录因子,采用逆转录聚合酶链反应( Reverse transcription-polymerase chain reaction ,RT-PCR)检测外周血单个核细胞内T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γt mRNA的表达;采用细菌16S rDNA方法测定粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌含量。 结果:支气管哮喘患儿在急性发作期时发生肠道菌群失调,表现在双歧杆菌和乳酸杆菌为代表的厌氧菌数量下降,大肠杆菌和肠球菌为代表的需氧菌数量变化不大,双大肠杆菌歧杆菌/(Bifidobacteria/ escherichia coli, B/E)值下降。随着治疗和症状改善,恢复期时双歧杆菌数量上升较其他细菌为快,但整体菌群结构并未扶正。对于免疫学指标的观察发现,支气管哮喘患儿在急性发作期时外周血PBMC中Th2和Th17细胞百分比以及血浆中Th2和Th17细胞因子IL-4和IL-17浓度均高于健康对照组;Th1和Treg细胞百分比以及血浆中Th1和Treg细胞因子INF-γ和TGF-β1浓度均低于健康对照组,出现Th1/Th2和Treg/Th17失衡。缓解期Th2和Th17细胞百分比及血浆相应细胞因子浓度随疾病的回复而降低,但仍高于健康对照组,仍存在免疫紊乱。支气管哮喘患儿Th1细胞与血浆中INF-γ浓度和外周血PBMC中T-bet表达呈正相关;Th2细胞与血浆中IL-4浓度和外周血PBMC中GATA3表达呈正相关;Treg细胞与血浆中TGF-β1浓度和外周血PBMC中Foxp3表达呈正相关;Th17细胞与血浆中IL-17浓度和外周血PBMC中ROR-γt表达呈正相关,表明Th1/Th2和Treg/Th17主要受其特异性转录因子调控。肠道菌群中B/E值与Th1/Th2和Tregs/Th17之间均呈正相关关系。 结论:Th1/Th2细胞分化失衡在支气管哮喘发病机制中发挥重要作用,除了Th2细胞免疫应答活跃外,调节性T细胞以及Th17细胞也参与了在支气管哮喘的发病过程中,表明除了经典的Th1/Th2免疫失衡外,还存在Treg/Th17免疫失调。肠道共生菌刺激机体免疫系统的发育,在支气管哮喘中通过下调Th2应答,纠正Th1/Th2失衡。肠道菌群结构和功能的完整性对维系CD4+CD25+T细胞功能发重要作用,支气管哮喘患儿肠道菌群失调损伤了CD4+CD25+T细胞的免疫抑制功能,导致免疫耐受被打破是支气管哮喘病理过程的重要机制。其研究结论为今后药品的开发和应用,并在早期及时恢复肠道微生态平衡,阻断异常免疫的某个环节,防治支气管哮喘提供了重要理论依据。 第二部分:肠粘膜屏障功能、CD4+T细胞亚群及相应转录因子在儿童过敏性紫癜病理机制中的调控作用 目的:探讨肠粘膜屏障功能变化及其免疫网络中CD4+T亚群及相应细胞因子和特异性转录因子在过敏性紫癜病理机制中的相互调控作用。 方法:采用流氏细胞术测定41例过敏性紫癜患儿和30例健康儿童外周血单个核细胞CD3+CD8-INF-γ+ IL-4(-Th1), CD3+CD8-INF-γ- IL-4+(Th2),CD4+CD25+T细胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+(Th17)细胞百分比;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆中INF-γ、IL-4、TGF-β1、IL-9和IL- 17细胞因子水平;T-bet是调控Th1细胞分化,GATA3是调控Th2细胞分化,Foxp3是调控调节性T细胞分化,ROR-γt是控制Th17分化的特异性转录因子,由逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血PBMC内T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γt mRNA表达;采用细菌16S rDNA方法测定粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌含量。采用液相色谱仪测定尿中乳果糖(lactulose, L)与甘露醇(mannito, M)水平,计算L/M值评价肠粘膜通透性。 结果:过敏性紫癜患儿在急性期即发生肠道菌群失调,表现为肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌下降,大肠杆菌和肠球菌减少不明显,以乳酸杆菌数量下降为显著。治疗后随着临床症状的改善,恢复期时双歧杆菌数量上升较乳酸杆菌为快,肠道仍处于微生态紊乱状态,并且肠道中乳酸杆菌数量和B/E值和尿L/M值呈负相关。在过敏性紫癜急性期时,外周血PBMC中Th2和Th17细胞亚群百分比以及血浆中IL-4、IL-17水平和特异性转录因子GATA3、ROR-γt mRNA表达均高于健康对照组;Th1和Treg细胞百分比以及血浆中INF-γ、TGF-β1水平和特异性转录因子T-bet、Foxp3 mRNA表达均低于健康对照组,出现Th1/Th2和Treg/Th17免疫失衡。恢复期时Th2和Th17细胞百分比及IL-4、IL-17水平和特异性转录因子GATA3和ROR-γt表达有所下降,但仍存在Th1/Th2、Treg/Th17免疫失衡。过敏性紫癜患儿血浆中INF-γ与外周血PBMC中Th1细胞百分比、T-bet表达呈正相关;IL-4与外周血PBMC中Th2细胞百分比、GATA3表达呈正相关;TGF-β1与外周血PBMC中Treg细胞百分比、Foxp3表达呈正相关;IL-17与外周血PBMC中Th17细胞百分比、ROR-γt表达呈正相关。肠道菌群中B/E值和乳酸杆菌数量分别与Th1/Th2和Tregs/Th17呈正相关,与尿L/M比值呈负相关。 结论:过敏性紫癜患儿在急性期出现肠道微生态失衡,表现在肠道菌群B/E值下降,乳酸杆菌数量下降尤为显著,肠粘膜通透性下降,肠粘膜屏障功能遭到损坏,肠道共生菌所诱导的免疫耐受机制被打破,表现在外周血PBMC中CD4+CD25+T细胞百分比降低及其血浆TGF-β1水平降低,转录因子Foxp3表达下降,对以往经典的Th1/Th2细胞免疫失衡的发病理论进行了修订,认为过敏性紫癜的发病机制除了有Th1/Th2免疫失衡外,也存在Treg/Th17的免疫失调,并参与了疾病的病理过程。肠道乳酸杆菌和双歧杆菌在恢复机体免疫自稳状态,诱导免疫耐受方面发挥重要作用。研究结论从微生态学和免疫学角度阐明了过敏性紫癜的发病机制,探讨了肠道共生菌、免疫细胞、细胞因子以及转录因子在疾病发生发展中的调控作用,为今后药品的开发不仅限于调整宿主的免疫功能,更要放眼于改善肠道微生态环境,为过敏性紫癜的临床治疗提供前期的理论依据。 第三部分参芪健脾方对肠道菌群失调大鼠肠粘膜屏障功能修复及免疫功能调整作用机制的实验研究 目的:前两部分研究已表明儿童过敏性疾病如支气管哮喘和过敏性紫癜的病理过程均发生肠道微生态失调和免疫调控机能失衡,故寻求改善微生态生境,调节免疫功能的药物,早期阻断疾病的恶性循环,防治过敏性疾病十分重要。本实验探讨参芪健脾方对肠道菌群失调大鼠修复肠粘膜屏障功能、抑制肠道细菌移位和调整免疫功能的作用机制研究,对开发中药方剂防治过敏性疾病具有重要临床价值。 方法:采用细菌培养法动态测定大鼠肠道菌群结构变化及肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和结肠组织的移位细菌量;应用光镜和电子显微镜观察大鼠肠粘膜组织超微结构变化;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)动态测定大鼠肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和肠粘膜组织中Toll样受体mRNA转录水平。 结果:肠道菌群失调模型建立,大鼠肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌和肠杆菌数量均较对照组下降。肠粘膜组织受损,表现在肠绒毛、肠上皮细胞以及紧密连接的受损。大鼠体内Toll样受体mRNA转录水平早期受抑制,肠系膜淋巴结、肠粘膜、肝脏和脾脏组织出现肠道细菌移位情况。大肠杆菌攻击可加重肠道菌群失调和肠粘膜损伤程度,上调Toll样受体mRNA转录水平,加剧细菌移位程度。参芪健脾方和乳酸杆菌可减轻由肠道菌群失调引起的Toll样受体mRNA转录受抑及细菌移位程度,扶正肠菌群结构,修复损伤的肠粘膜屏障功能。 结论:阐明了肠道菌群、肠粘膜屏障功能和肠道细菌移位以及免疫功能之间的互为因果,相互影响的关系。肠道菌群失调改变了肠道微生态生境,损伤了肠粘膜上皮细胞结构,促发肠道细菌移位,致使Toll样受体mRNA转录受抑。参芪健脾方在维护机体微生态平衡、修复肠粘膜屏障功能和抑制肠道细菌移位方面相同于乳酸杆菌制剂,参芪健脾方可调整机体免疫功能,尤其是天然免疫的模式识别受体,对于过敏性疾病的早期防治具有临床价值。


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