Prx2、Foxo3a、Nrf2在脑梗死大鼠脑组织的表达及普罗布考和阿托伐他汀联合应用的神经保护机制的研究

【摘要】：目的:脑血管病已成为我国居民死亡的第一原因和成人残疾的第一原因,以缺血性脑血管病最为常见。脑梗死后最初几天的继发性脑损伤常导致病情加重,主要包括氧化应激、细胞炎症反应、Ca~(2+)稳态失调、细胞毒性作用、活性氧及自由基等,这是一个复杂的病理级联反应,其中过度炎症免疫反应和氧化应激存在于脑梗死后坏死和缺血区域,成为导致继发损伤的主要原因。因此,如何减轻炎症反应和氧化应激损伤成为治疗急性脑梗死的重要方法。然而,抗炎和抗氧化应激联合治疗在缺血性脑血管病的临床研究中还未能取得较好的效果。联合应用抗炎和抗氧化的药物可能为脑梗死的治疗带来新的突破。阿托伐他汀(atorvastatin)和普罗布考(probucol)是临床常用的调脂药物,除了能调节血脂外,大量的药理和临床研究已证实其分别具有较好的抗炎和抗氧化作用,但其联合应用是否会有协同作用及可能的机制尚不完全明确。 Peroxiredoxin2(Prx2)在细胞内主要起抗过氧化和调节H_2O_2介导的信号转导作用以及细胞内抗活性氧(ROS)的防御作用。Foxo3a是Foxo转录因子中的一员,在细胞代谢中发挥着广泛的作用,如通过清除ROS、调节抗氧化酶发挥强大的抗氧化作用,以及延长寿命,糖代谢等。Nrf2可诱导多种抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的协同表达,清除细胞内ROS从而发挥较强的抗氧化作用。Prx2,Foxo3a及Nrf2参与缺血后脑损伤的病理生理过程,在缺血性脑血管病引起的神经细胞损伤中起着重要的作用。 本实验在大鼠永久性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)所致的脑缺血模型上观察脑缺血后Prx2,Foxo3a的动态表达规律,以及阿托伐他汀和普罗布考联合应用在脑缺血损伤中的神经保护作用及其对Prx2,Foxo3a及Nrf2的影响。 方法:采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,应用改良Longa线栓法建立大鼠右侧MCAO模型。实验一:观察脑缺血后不同时间点Prx2和Foxo3a的动态表达;实验分为正常对照组、缺血后3 h、6 h、12 h、24h、48 h、72 h六个时间点组。实验二:测定脑梗塞后普罗布考和阿托伐他汀的神经保护作用。随机分为假手术组(Sham)、MCAO组、普罗布考组(MCAO+ probucol 150 mg/kg, P)、阿托伐他汀和普罗布考联合组(MCAO+ atorvastatin (10 mg/kg))+ probucol (150 mg/kg), A + P)、阿托伐他汀组(MCAO+ atorvastatin 10 mg/kg, A)。给药组动物梗死后根据不同的组别立即腹腔注射相应药物,MCAO组和Sham组立即给予等容积生理盐水。术后24 h和72 h对大鼠进行神经功能评分。评分完毕将动物断头处死,用干湿重法测定脑组织含水量,用2% 2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测算脑梗死体积,用免疫组化、Western Blot和逆转录多聚酶链反应(Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)来观察Prx2,Foxo3a,Nrf2的表达情况。实验三:观察脑缺血后阿托伐他汀和普罗布考对血脑屏障的影响。应用激光共聚焦技术观察干预前后脑血管外IgG含量变化,Western blot检测干预前后血脑屏障紧密连接蛋白claudin-5的表达。 结果: 1脑缺血3 h后Prx2,Foxo3a表达开始降低,在蛋白水平于24 h达低谷,48h逐渐升高;在mRNA水平于48小时达低谷,72小时逐渐升高。 2 MCAO组、普罗布考组、普罗布考和阿托伐他汀联合组、阿托伐他汀组大鼠均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。联合用药组的神经功能评分低于MCAO组,但差异无统计学意义(A+P vs. MCAO: 2.70±0.68 vs. 3.40±0.70, P 0.05)。普罗布考组和阿托伐他汀组与MCAO组相比,神经功能评分无明显差异(P vs. MCAO: 3.10±0.74 vs. 3.40±0.70, P 0.05; A vs. MCAO: 3.2±0.63 vs. 3.40±0.70, P 0.05)。 3普罗布考组、联合用药组和阿托伐他汀组病变侧脑组织含水量均低于MCAO组,差异有统计学意义(For 24 h, P vs. MCAO: 82.41%±0.59% vs. 85.47%±0.41%, P 0.05; A+P vs. MCAO: 80.20%±1.02% vs. 85.47%±0.41%, P 0.05; A vs. MCAO: 81.67±0.58% vs. 85.47%±0.41%, P 0.05. For 72 h, P vs. MCAO: 82.59%±0.43% vs. 85.95%±0.31%, P 0.05; A+P vs. MCAO: 80.99%±0.89% vs. 85.95%±0.43%, P 0.05; A vs. MCAO: 81.37±1.32% vs. 85.95%±0.43%, P 0.05.)。并且在梗塞后24h联合用药组病变侧脑组织含水量明显低于普罗布考组或阿托伐他汀组,差异有统计学意义(A+P vs. P: 80.20%±1.02% vs. 82.41%±0.59%, P 0.05; A+P vs. A: 80.20%±1.02% vs. 81.67±0.58%, P 0.05)。 4 Sham组无梗死灶。与MCAO组相比,普罗布考和阿托伐他汀联合用药组梗死体积明显减小(P 0.05),普罗布考组或阿托伐他汀单独应用组与MCAO组相比,梗塞体积无明显减小。 5普罗布考组和联合用药组Prx2,Foxo3a和Nrf2的阳性细胞数、蛋白水平及mRNA水平表达均增高,与MCAO组相比结果有统计学意义(P 0.05),阿托伐他汀组与MCAO组相比结果无统计学意义。 6激光扫描共聚焦技术显示Sham组脑组织无明显的IgG外渗,MCAO组、普罗布考组和阿托伐他汀组病变侧脑组织可见大量斑片状呈绿色荧光的IgG,联合用药组IgG含量减少。 7与假手术组相比,脑缺血后claudin-5表达明显下降。联合用药组可以上调缺血脑组织内claudin-5的表达,与MCAO组相比结果有统计学意义(P 0.05)。普罗布考组或阿托伐他汀组与MCAO组相比结果无统计学意义(P 0.05)。 结论:普罗布考和阿托伐他汀联合用药组具有较好的协同保护作用,可以有效减少缺血后的脑组织损伤。其作用可能与上调Prx2,Foxo3a,Nrf2的表达;上调claudin-5的表达,改善血脑屏障有关。