慢性间歇性低压低氧抗大鼠胶原诱导性关节炎作用及其免疫学机制

【摘要】：大量研究表明,慢性间歇性低压低氧(Chronic intermittent hypobaric hypoxia, CIHH)对机体多种组织、器官均有益处,例如增强机体对缺血、缺氧耐受性,对抗缺血/再灌注所致心脏功能损伤及心律失常,保护神经、肝脏等器官组织,以及降压作用。CIHH作为增强机体、组织对缺氧耐受性的手段在体育运动训练中也被广泛应用。有限的研究表明CIHH对机体的免疫机能具有影响作用。我们以往研究显示,CIHH处理具有免疫调节作用,可对抗急性低氧所致的免疫功能失调。也有文献报道CIHH对慢性阻塞性支气管炎及支气管哮喘有一定辅助治疗作用。因此,有理由推测CIHH对免疫性疾病,例如类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)具有某种预防或治疗作用。 类风湿关节炎是一种病因尚未完全明确的慢性全身性自身免疫炎性疾病,以进行性、对称性、多关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现,同时可伴发心血管、神经系统及代谢系统疾病。有关类风湿关节炎的研究和各种治疗手段的开发是目前医学领域研究的热点之一。胶原诱导性关节炎(Collagen induced arthritis , CIA)大鼠模型是目前应用较广泛的且较成熟的整体动物实验模型,该模型关节组织病理学与血中的变化特点与人类RA相似,为一种典型的免疫性炎症模型,常用于关节炎的研究。本研究旨在通过CIA动物模型,给以不同程度的CIHH处理,利用流式检测、免疫组化、ELISA、分子生物学等方法,从动物整体、离体组织及细胞不同水平,系统、动态地观察CIHH预处理和后处理对胶原诱导性关节炎的影响,并深入探讨其免疫学机制。 本研究分为四部分:(1)应用ELISA、HE染色、免疫组化等方法观察CIHH对大鼠CIA的影响,初步探讨其抗炎作用机制;(2)应用流式细胞术、ELISA、免疫组织化学法观察CIHH对CIA大鼠T淋巴细胞亚群的影响,探讨CIHH抗CIA作用的细胞免疫机制。(3)应用原位末端标记法(Terminal dUTP nick end labeling ,TUNEL)、流式细胞术及免疫组化等方法观察CIHH对CIA大鼠细胞凋亡率的影响,探讨CIHH抗CIA作用的细胞凋亡机制。(4)应用Western blots方法观察CIHH对CIA大鼠核转录因子(nuclear factor-kappa B, NF-κB)和低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α)蛋白表达的影响,探讨CIHH抗CIA作用的信号转导机制。 Ⅰ慢性间歇性低压低氧抗大鼠胶原诱导性关节炎作用 目的:应用ELISA、HE染色、免疫组化等方法研究CIHH对大鼠CIA的影响,并探讨其抗炎作用机制。 方法:雄性成年SD大鼠50只,随机分为5组: CIHH预处理组(Pre-T)、预处理对照组(Pre-C)、CIHH后处理组(Post-T)、后处理对照组(Post-C)及空白对照组(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分别在CIA造模前和造模后给以28天模拟海拔3000m(PO2=108.8mmHg,O2:14%)、每天5小时的CIHH;Pre-C和Post-C只给予CIA造模;Con大鼠不给任何处理。测定大鼠双后足爪厚度,以关节炎指数(AI)评价关节炎程度;HE染色观察踝关节组织形态学变化;免疫组化SP法检测关节滑膜组织细胞因子TNF-α、IL-6表达;ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平。 结果:1 Pre-T大鼠CIA发生率(20%)明显低于Pre-C组大鼠(70%),Post-T与Post-C间CIA发生率无明显变化。 2 Pre-T和Post-T大鼠的足爪厚度和AI值低于Pre-C和Post-C组大鼠(P 0.05)。 3 Pre-C及Post-C关节炎大鼠踝关节滑膜细胞明显增生,炎细胞浸润增加,形成血管翳,侵蚀软骨及骨,Pre-T和Post-T大鼠关节滑膜组织病理改变明显减轻。 4与Pre-C及Post-C大鼠比较,Pre-T和Post-T大鼠关节滑膜组织及血清TNF-α、IL-6水平明显降低(P 0.05)。小结: CIHH处理具有抗类风湿关节炎作用,可有效预防大鼠胶原诱导性关节炎的发生,减轻CIA大鼠关节组织滑膜炎症,改善关节组织病理损伤,这种保护作用可能与CIHH抑制炎性细胞因子TNF-а、IL-6的产生有关。 Ⅱ慢性间歇性低压低氧抗大鼠胶原诱导性关节炎作用的T淋巴细胞免疫机制 目的:观察CIHH对CIA大鼠T淋巴细胞亚群的影响,并探讨其抗CIA作用的细胞免疫机制。 方法:雄性成年SD大鼠50只,随机分为5组: CIHH预处理组(Pre-T)、预处理对照组(Pre-C)、CIHH后处理组(Post-T)、后处理对照组(Post-C)及空白对照组(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分别在CIA造模前和造模后给以28天模拟海拔3000m(PO2=108.8mmHg,O2:14%)、每天5小时的CIHH;Pre-C和Post-C只给予CIA造模;Con大鼠不给任何处理。流式细胞术检测血液CD4、CD8 T淋巴细胞;ELISA法检测血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平;免疫组化法检测关节滑膜组织IFN-γ、IL-4、IL-17表达。 结果:1与Pre-C、Post-C组动物相比,Pre-T、Post-T组动物外周血CD4明显下降(P 0.05),CD8升高,CD4/CD8比值降低(P 0.05),与Control组比较无明显差异(P 0.05)。2 Pre-T组动物血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值及IL-17水平较Pre-C组动物明显下降(P 0.05);Post-T组动物较Post-C组动物血清中IFN-γ、IFN-γ/ IL-4比值及IL-17水平明显下降,IL-4明显升高(P 0.05)。3 Pre-T组动物滑膜组织IFN-γ、IL-4、IL-17水平较Pre-C组动物明显减低(P 0.05);与Post-C组比较,Post-T组动物滑膜组织IFN-γ、IL-17水平明显下降,IL-4明显升高(P 0.05)。 小结: CIHH处理具有稳定CIA大鼠CD4+T细胞的增殖、维持T淋巴细胞亚群CD4/CD8、Th1/Th2稳态、减少炎性细胞因子IL-17表达的作用。细胞免疫调节可能是CIHH抗胶原诱导性关节炎的作用机制之一。 Ⅲ慢性间歇性低压低氧抗大鼠胶原诱导性关节炎作用的细胞凋亡机制 目的:观察CIHH对CIA大鼠滑膜细胞和脾脏淋巴细胞凋亡率的影响,探讨其抗CIA作用的细胞凋亡机制。 方法:雄性成年SD大鼠50只,随机分为5组:CIHH预处理组(Pre-T)、预处理对照组(Pre-C)、CIHH后处理组(Post-T)、后处理对照组(Post-C)及空白对照组(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分别在CIA造模前和造模后给以28天模拟海拔3000m(PO2=108.8mmHg,O2:14%)、每天5小时的CIHH;Pre-C和Post-C只给予CIA造模;Con大鼠不给任何处理。应用原位末端标记法(Terminal dUTP nick end labeling ,TUNEL)检测膝关节滑膜细胞的凋亡率;脾脏组织制备成细胞悬液用流式细胞术检测CD3+T淋巴细胞凋亡率;用免疫组化SP法检测滑膜细胞及脾脏细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。 结果:1与Pre-C及Post-C大鼠比较,Pre-T和Post-T大鼠滑膜细胞及脾脏淋巴细胞的凋亡率明显增加(P 0.05)。 2与Pre-C及Post-C大鼠比较,Pre-T和Post-T动物滑膜组织细胞及脾脏淋巴细胞Bcl-2蛋白表达明显减低(P 0.05),Bax蛋白表达明显升高(P0.05)。 小结: CIHH预处理和后处理可能通过抑制Bcl-2蛋白表达,促进Bax蛋白表达促进关节滑膜细胞和脾脏T淋巴细胞的凋亡,从而发挥抗大鼠CIA作用。 IV慢性间歇性低压低氧抗大鼠胶原诱导性关节炎作用的信号转导机制 目的:应用分子生物学技术观察CIHH对CIA大鼠核转录因子(nuclear factor-kappa B, NF-κB)和低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α)蛋白表达的影响,探讨CIHH抗CIA作用的信号转导机制。 方法:雄性成年SD大鼠50只,随机分为5组: CIHH预处理组(Pre-T)、预处理对照组(Pre-C)、CIHH后处理组(Post-T)、后处理对照组(Post-C)及空白对照组(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分别在CIA造模前和造模后给以28天模拟海拔3000m(PO2=108.8mmHg,O2:14%)、每天5小时的CIHH;Pre-C和Post-C只给予CIA造模;Con大鼠不给任何处理。应用免疫组化SP法检测滑膜组织VEGF、TGF-β蛋白表达;滑膜组织匀浆后应用Western blots方法检测HIF-1α、NF-κB蛋白表达。 结果:1 Pre-T组动物滑膜组织细胞VEGF、TGF-β蛋白表达明显低于Pre-C组动物(P 0.05)。Post-T组动物滑膜组织细胞VEGF、TGF-β蛋白表达亦明显低于Post-C组动物(P 0.05)。2 Pre-T组动物滑膜组织HIF-1α、NF-κB蛋白表达明显低于Pre-C组动物(P 0.05),NF-κB高于Control组动物(P 0.05),而HIF-1α表达与Control组动物无明显差异(P 0.05)。Post-T组动物滑膜组织HIF-1α、NF-κB蛋白表达明显低于Post-C组动物(P 0.05),同时明显高于Control动物(P0.05)。 小结: CIHH预处理和后处理可能通过抑制信号转录因子NF-κB和HIF-1α蛋白表达,进而抑制VEGF、TGF-β蛋白表达,从而减轻关节病理损伤,发挥抗大鼠CIA作用。