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丁苯酞对家族性肌萎缩侧索硬化动物模型的神经保护作用

阴均涛  
【摘要】:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosisALS)又名运动神经元病(motor neuron disease MND)或卢·格里格(Lou Gehrig)病,是一种致命性神经退行性疾病,选择性累及皮层、脑干和脊髓的运动神经元,临床表现为进行性加重的肌萎缩、无力和吞咽困难、饮食水发呛,最终因呼吸肌麻痹死亡。90%的ALS为散发性(SALS),10%的ALS为家族性(FALS),其中约20%的FALS与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变有关。该病目前缺乏有效的治疗方法,病人的存活期一般为3-5年。尽管多年来有许多药物治疗研究,利鲁唑仍是惟一被FDA批准应用于治疗ALS的药物,但也只能有限的延长病人的生存期,因此寻找有效的治疗药物是非常必要的。 尽管ALS发病机制不清,异常磷酸化的神经丝在脊髓前角运动神经元聚集被认为是ALS的重要病理特征之一。神经丝(Neurofilaments NF)属于细胞骨架蛋白中的一种,根据其分子量的不同分为三个不同的亚基蛋白,分别为神经丝重链(NF-H,200-kDa)、神经丝中链(NF-M,160-kDa)和神经丝轻链(NF-L,68-kDa)。其中NF-L在神经丝的组装方面起重要作用, NF-M和NF-H在维持神经丝的交联作用、轴突细胞骨架蛋白的稳定性、轴突直径大小和轴浆转运方面起重要作用。一般情况下,神经丝在神经元胞浆内以非磷酸化形式存在,而轴索内的神经丝以磷酸化形式存在,对维持轴索的直径等有重要作用。但是,异常磷酸化的神经丝的可以抑制神经丝蛋白的降解,导致其在核周异常聚集,最终引起神经元变性、死亡。 丁苯酞(dl-3-n-Butylphthalide)是芹菜(中国芹菜)种子的提取物。在2002年,首次被中国国家食品药品监督管理局批准应用于中风患者。实验证明丁苯酞具有减少氧化应激损伤和改善线粒体功能、抑制炎症反应和抗细胞凋亡的作用。最近,在阿尔茨海默病鼠模型中研究显示,丁苯酞能明显改善转基因鼠的认知功能。然而,目前关于丁苯酞在ALS治疗作用的相关研究报道很少。 基于此,本实验观察丁苯酞对SOD1-G93A转基因鼠的行为学影响,并进一步探讨可能的神经保护作用机制。本研究分为两部分: 第一部分预防应用不同剂量的丁苯酞对家族性肌萎缩侧索硬化鼠模型的神经保护作用 目的:观察不同剂量的丁苯酞在发病前给药对SOD1-G93A转基因鼠的行为学影响,并观察180mg/kg丁苯酞治疗组对SOD1-G93A转基因鼠脊髓前角运动神经元神经丝重链的分布和表达水平的影响。 方法: 1动物分组及给药方法 随机将48只携带SOD1-G93A基因的小鼠分为四个实验组(n=12,雌性6只,雄性6只):分别为低剂量治疗组(60mg/kg)、中剂量治疗组(120mg/kg)、高剂量治疗组(180mg/kg)和安慰剂组。 丁苯酞(纯度98%)由石药集团恩必普药业有限公司提供,三个治疗组分别以6mg/ml,12mg/ml和18mg/ml的浓度将丁苯酞溶于玉米油中,安慰剂组给玉米油。丁苯酞和玉米油按10ml/kg/d的剂量给药。有12只(6只雌性和6只雄性)同窝阴性对照不接受任何治疗。SOD1-G93A转基因鼠的给药时间为第42天。 2行为学观察 2.1发病时间和死亡时间的判定 在83天进行一般状况评分,评分标准参考Vercelli等人研究的1-5分评分法:4分为发病时间,1分为死亡时间。 5分:无运动功能障碍 4分:将小鼠悬吊时出现后肢伸展异常或震颤 3分:明显的后肢无力、步态异常 2分:双后肢完全瘫痪,爬行仅靠前肢。 1分:双后肢完全瘫痪,并且将小鼠仰卧后20s内不能翻转。 2.2旋转实验 第10周开始转棒实验,实验前5天为转基因鼠的适应和学习阶段,以后每周测一次。转棒仪从1转/分开始,3分钟内达到30转,每只小鼠测三次,记录转棒时间最长的一次。 3免疫组化 10%水合氯醛将小鼠麻醉后,心脏灌注4%多聚甲醛固定20min,取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h,振动切片30μm厚,免疫组织化学法观察髓前角神经元SMI-31和SMI-32的表达分布。 4免疫印迹 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射将小鼠麻醉后,新鲜取小鼠脊髓腰段,液氮速冻,-80℃储藏,提取总蛋白并用蛋白免疫印迹的方法检测SOD1-G93A转基因鼠腰髓SMI-31蛋白表达。 5统计学方法 我们采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。各组数据用均数±标准误(x±SEM)表示。Kaplane-Meier(K-M)生存分析用于发病时间和生存时间的统计分析,转棒实验使用重复测量设计多因素方差分析进行统计。其他数据采用单因素方差分析或秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1发病时间和生存时间 1.1发病时间 与安慰剂组相比,60mg/kg、120mg/kg和180mg/kg丁苯酞治疗组分别使SOD1-G93A转基因鼠的发病时间推迟了11、6、和13天,三组均有统计学意义。 1.2生存时间 与安慰剂组相比,60mg/kg、120mg/kg和180mg/kg丁苯酞治疗组分别使SOD1-G93A转基因鼠的生存期延长了6、2、和12天,仅180mg/kg治疗组有显著统计学差异(P=0.08)。 2运动功能的评价 与安慰剂组相比,从13周到16周,180mg/kg治疗组明显延长了SOD1-G93A转基因鼠的转棒时间,有统计学意义。60mg/kg和120mg/kg治疗组可轻微延长转棒时间,但与安慰剂组相比无统计学意义。 3免疫组化 SMI-32免疫组化结果显示,与安慰剂组相比,180mg/kg治疗组脊髓前角SMI-32阳性运动神经元数量明显增加,P=0.000,有显著的统计学差异,且胞浆染色深,突起相对多。 SMI-31免疫组化的结果显示,与安慰剂组相比,180mg/kg治疗组脊髓前角SMI-31阳性运动神经元数量明显少,P=0.000,有显著统计学差异,且核周着色相对较浅,未见明显的包涵体形成。 4免疫印迹 与安慰剂组相比,丁苯酞治疗组SMI-31的表达水平是降低的,P=0.006,有统计学差异。 结论:丁苯酞具有推迟SOD1-G93A转基因鼠发病时间、延长生存期和改善其运动功能的作用,部分抑制神经丝异常磷酸化。第二部分丁苯酞对发病后雄性家族性肌萎缩侧索硬化鼠模型行为学的影响 目的:观察丁苯酞对发病后雄性SOD1-G93A转基因鼠生存期和运动功能的影响。 方法: 1分组和给药方法 将20只雄性SOD1-G93A转基因鼠随机分为2组(N=10,雄性):(1)丁苯酞(180mg/kg)治疗组,第90天给药;(2)安慰剂组,第90天给玉米油。 丁苯酞(纯度98%)由石药集团恩必普药业有限公司提供,将丁苯酞以18mg/ml的浓度溶于玉米油中,安慰剂组给玉米油。丁苯酞和玉米油按10ml/kg/d的剂量给药。给药方式为灌胃法。 2行为学测定 第13周开始转棒实验,每周测一次,实验前5天为转基因鼠的适应和学习阶段,以后每周测一次。转棒仪从1转/分开始,3分钟内达到30转,每只小鼠测三次,记录转棒时间最长的一次。 3死亡时间的判定 参考Vercelli等人研究的1-5分评分法,4分为发病时间,1分为死亡时间。 4统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。各组数据均用均数±标准误(x±SEM)表示。Kaplane-Meier(K-M)生存分析用于发病时间的统计分析,转棒实验采用重复测量设计多因素方差分析进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1生存时间 与安慰剂组相比,丁苯酞治疗组转基因鼠的生存时间被延长了约8天,P=0.046,有统计学意义。 2运动功能评价(转棒法) 从第13周到第18周,丁苯酞治疗组能轻微延长转基因鼠的转棒时间,但与安慰剂相比,P0.05,无统计学差异。 结论:丁苯酞能延长发病后雄性SOD1-G93A转基因鼠生存时间作用。


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