小胶质细胞激活对皮质神经元SOD活性和MDA含量的影响

【摘要】：目的：弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury, DAI）是在特殊外力作用下发生的以神经元轴索肿胀、断裂为主要特征的弥漫性脑损伤，可单独出现也可伴随其他病理改变，是导致颅脑损伤患者死亡、重残和植物状态生存的最常见原因之一[1]。典型表现为意识障碍，且预后较差。研究表明，DAI后脑功能障碍不仅是由于最初的机械外力等作用所致的原发性损伤，很大程度上与损伤后发生的复杂的神经元“二次打击”（神经元继发性损伤）有关[2]，其继发性损伤是指损伤后一系列生化和细胞反应导致的延迟性轴索断裂[3]。 前期实验已经观察到DAI后，在β-APP阳性表达的轴索周围有大量的小胶质细胞被激活。已有研究表明，活化的小胶质细胞可出现“呼吸爆发现象”，产生数量惊人的自由基，引起脂质过氧化，还可引起细胞成分脂质、蛋白之间相互交联，损伤神经元功能。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase, SOD）作为存在于胞浆和线粒体中的一种金属蛋白酶，其活性高低可间接反映组织自由基的含量和脂质过氧化程度。丙二醛（malondialdehyde, MDA）作为细胞膜多不饱和脂肪酸受到活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）攻击后发生脂质过氧化反应的终产物之一，其含量变化可间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。因此，神经损伤的机制不仅限于直接的细胞因子作用，小胶质细胞激活后产生的毒性作用或许更为重要。然而在体外培养条件下小胶质细胞是否可通过介导氧化损伤途径参与皮质神经元的迟发性进行性损伤尚未见报道。 本实验采用乳鼠大脑皮质原代培养，首先给予一定量Aβ1-40诱导激活小胶质细胞，再用其条件培养基刺激皮质神经元。通过SOD活性和MDA含量变化系统观察小胶质细胞是否对皮质神经元造成氧化损伤，以此探讨在体外实验中活化的小胶质细胞与皮质神经元之间的相互作用。 方法：原代培养新生SD乳鼠（24h内）大脑皮质小胶质细胞。用不同浓度的可溶性Aβ1-40诱导激活小胶质细胞后，采用ELISA法检测培养上清中TNFα和IL-1β的分泌量以确定小胶质细胞最佳活化状态。加入米诺环素后用Real Time PCR法和ELISA法检测TNFα和IL-1β的表达变化，观察其抑制小胶质细胞活化的作用。再用活化后的小胶质细胞条件培养基刺激原代培养的皮质神经元，随机分为4组：对照组、1/2Aβ-MCM组、1/4Aβ-MCM组、1/8Aβ-MCM组。每组包括5个时间点：1h、3h、6h、12h、24h。黄嘌呤氧化酶法测定各组皮质神经元超氧化物歧化酶（SOD）活力高低，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量变化，以此观察神经元的氧化损伤程度。 数据用均数±标准差（Mean±SD）表示，用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析。各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA），用最小显著差法（least significant difference，LSD）作两两比较。P0.05为有显著性差异。 结果: 1Aβ1-40对小胶质细胞的诱导激活及米诺环素的抑制作用： ELISA法结果显示，1μM Aβ1-40孵育6h能成功诱导激活小胶质细胞分泌TNFα、IL-1β，与对照组相比有显著性差异（p0.01），并且这种诱导激活作用具有时间及浓度依赖性。加入0.2μM米诺环素后Real TimePCR法和ELISA法检测结果均表明，米诺环素可明显抑制小胶质细胞TNFα和IL-1β的分泌，MC+Aβ组与Aβ组相比明显下降（p0.01），与对照组相比无显著性差异（p0.05）。因此我们选用终浓度为1μM的Aβ1-40孵育小胶质细胞6h后的培养上清作为最佳条件培养基刺激皮质神经元。 2小胶质细胞条件培养基对皮质神经元的氧化应激损伤： 结果显示，经不同浓度条件培养基刺激后，皮质神经元SOD活力值均低于对照组，以1/2Aβ-MCM组最明显，24h达到最低，与对照组相比，有明显的统计学意义（P0.05），且有随刺激时间延长及刺激因子含量增加而渐低的趋势，而1/4Aβ-MCM组和1/8Aβ-MCM组各时间点皮质神经元SOD活力值与对照组相比均无显著性差异。而MDA的含量均高于对照组，以1/2Aβ-MCM组最明显，24h达到最高，与对照组相比有明显的统计学意义（P0.05），有随刺激时间延长及刺激因子含量增加而渐增的趋势。 结论： 1成功建立活化的小胶质细胞条件培养基促皮质神经元氧化损伤模型。 2活化的小胶质细胞可通过氧化应激途径对皮质神经元造成损伤。