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莱菔硫烷对涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖和凋亡的影响

庄志征  
【摘要】:目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)作为一种最常见的恶性肿瘤,以极强的浸润性和高远处转移率为重要特征,发病率在口腔颌面部恶性肿瘤中居第二位。目前临床治疗手段以手术切除治疗为主,但手术切除后也常有局部复发和远处转移,其远端转移率在口腔颌面部居首位。涎腺腺样囊性癌的发病及转移机制目前仍不清楚。因此探索新的治疗方法,以提高对腺样囊性癌的疗效,减少局部复发和远处转移的发生,改善患者的生存质量显得尤为必要。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是主要从十字花科蔬菜中提取的一种具强抗癌作用的植物化学活性物质,近年来相继有研究显示莱菔硫烷及其主要成分具有抗肿瘤的作用,但莱菔硫烷是否有诱导人腺样囊性癌细胞凋亡的作用,国内外尚未见报道。本研究拟对体外培养的人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞经不同浓度、不同时间莱菔硫烷作用后,观察不同浓度、不同作用时间下莱菔硫烷对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系是否具有抑制其增殖和诱导其凋亡的作用,探讨其可能的分子作用机制,旨在为腺样囊性癌的多模式治疗中拓展新的植物化学药物治疗提供实验资料。 方法: 1材料 1.1ACC-M:上海交通大学口腔颌面外科实验室提供,建立于1995年; 1.2莱菔硫烷(SFN):购自美国LKT实验室,纯度≥98% 2方法 2.1药液配制:莱菔硫烷用二甲基亚砜溶解配制成100mmol/L储存液,使用前用RPMI1640培养液稀释。 2.2细胞培养:培养液采用RPMI1640加入10%的胎牛血清和链霉素(100μg/mL)、青霉素(100U/mL),置37℃、5%CO2恒温恒湿箱培养,约72-96小时可以传代。 2.3MTT比色试验:取对数生长期细胞经消化液(0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合液)消化后制成5.0×104个/mL细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μl,培养24h后,分别加入含莱菔硫烷溶液200μl,使各孔药液终浓度为5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、100μM,并设对照组和调零孔,每组6个复孔。置培养箱继续培养,在分别培养24、48、72小时后,使用微量移液器予每孔加入浓度为5g/L的MTT溶液20μl,继续培养4h,弃去上清,予每孔加入200μl二甲基亚砜,于振荡器上振荡摇匀约15分钟,放入酶标仪(490nm)测定各孔吸光度值,重复三次,取均值计算生长抑制率。 2.4台盼蓝拒染实验:取对数生长期细胞制成5.0×104个/mL细胞悬液,接种于6孔板,每孔3mL,培养24h后,分别加入莱菔硫烷溶液,使终浓度为20μM、40μM,设对照组,继续培养24、48、72小时后以台盼蓝染液处理,在规定时间内分别计数各浓度时间的染色细胞(即死亡)与未染色细胞(即活细胞)的数量,进行统计分析。 2.5倒置相差显微镜观察:制备密度约为5.0×104个/mL细胞悬液,于50mL玻璃培养瓶中接种细胞,经培养,加药后分别观察细胞在对照组与含药培养液中(5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、100μM),各时间组(24h、48h、72h)的生长状况。 2.6光镜观察:制备密度约为5.0×104个/mL细胞悬液,于6孔板中放置玻璃盖玻片后接种细胞,置恒温箱培养,待细胞爬片成功,加入不含或含药培养液,分别培养24h、48h、72h后,Giemsa染色,置光镜下观察。 2.7电镜观察:将细胞接种于50mL培养瓶中贴壁成功后加入空白或浓度为40μM的含莱菔硫烷培养液,处理48h后,制备电镜标本,观察正常与凋亡细胞的结构差异。 2.8流式细胞术检测:将细胞接种于50mL培养瓶中贴壁成功后加入空白或含药培养液,经消化,离心,PBS液洗涤后加入Annexin-V-FITC和PI试剂标记处理细胞,置流式细胞仪检测,并对数据进行统计分析。 3统计分析 汇总所得实验数据,应用统计学方法对实验所测得的数据计算分析。 结果: 1MTT比色试验:莱菔硫烷可以显著抑制ACC-M细胞的生长,生长抑制率最大值高达81.05%。经计算,在同一处理时间的情况,含药组各浓度的生长抑制率不同(P 0.01),同一用药浓度的情况下,不同处理时间的生长抑制率不同(P 0.01)。抑制作用与用药浓度和处理时间之间均为正相关关系。 2台盼蓝拒染实验:用药组的活细胞比率随用药浓度和时间的增长呈明显下降趋势,经统计学分析,各时间组和各浓度组之间有统计学差异(P0.01),并制作直方图。 3倒置显微镜观察:对照组细胞贴壁生长,细胞生长迅速,多呈扁平多角形,呈“铺路石”状生长,胞质饱满,细胞中央处可见圆形的细胞核,用药组的细胞生长受到明显抑制,并且可见有脱壁细胞,部分贴壁的细胞变圆,皱缩变小,细胞核色深,细胞间连接松解。 4光镜观察:空白组的细胞呈多角形,分裂象较常见;含药组细胞核浆比较低,胞质浓缩,核仁变小、消失,可见核碎裂现象。 5电镜观察:空白组细胞结构完整,形态饱满,核仁明显,细胞内各细胞器清晰可见,可见明显分裂象;用药组胞质浓缩,核浆比例低,核仁减少甚至消失,出现明显的染色体边集现象,部分细胞呈花瓣形结构,并可见凋亡小体。 6流式细胞术检测:空白组细胞凋亡率低,且随时间增长并无明显趋势性变化,用药组细胞凋亡明显,且凋亡率随药物浓度增大与处理时间延长显著上升,经统计学分析,用药组细胞各时间组和各浓度组之间有统计学差异(P 0.01)。 结论: 莱菔硫烷具有抑制涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖的作用,并且这种增殖抑制的主要机制是由于诱导细胞凋亡,并且抑制作用呈药物浓度和处理时间依赖性关联。


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