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自体PRP对钛表面成骨细胞增殖的影响及PDGF的变化

杨莉  
【摘要】:目的:本研究采用体外实验,建立细胞与钛片复合培养的体外培养模型,将由兔全血所制备的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)作用于其自体骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),通过对钛片表面细胞数量及形态各项指标的检测,探讨不同浓度的自体PRP在不同时间段对钛片表面BMSCs增殖的影响以及血小板源性生长因子(PDGF)浓度的变化,进一步揭示PRP的作用机制,为临床根据生理和病理的需要,选择合适浓度的PDGF和PRP以及合理的应用时间提供实验依据。 方法:①BMSCs的培养:应用全骨髓培养法取兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行原代培养,具体方法如下:将2-3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉,在腿部胫骨平台处以16~#骨髓穿刺针垂直骨面,旋转进入骨髓腔,抽取4-6ml骨髓接种于培养瓶,待细胞达到90%融合时予以传代,用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态。②绘制细胞生长曲线:于1-10d每天将接种于24孔板的第3代BMSCs各取3孔,酶消法消化后显微镜下计数,绘制细胞生长曲线。③钛片的处理:将实验用直径10mm,厚度1mm已打磨光滑的圆形钛片依次用丙酮、无水乙醇、75%乙醇及双蒸水各超声清洗20min,高温高压消毒30min,无菌保存备用。④PRP的制备:采用二次离心法分离兔全血获得PRP,仪器计数法比较全血与PRP中的血小板数目。具体步骤是,方法同上麻醉实验动物,从颈动脉处抽取所有全血约120ml,第一次先以1100r/min速度水平离心机室温离心10min,吸取全部上清及红细胞液面下2-3mm,再以2200r/min的速度离心10min,弃2/3上清,所剩1/3液体即为PRP,以牛凝血酶激活后2小时内加入到细胞培养系中。⑤PRP作用于BMSCs:将配制的含不同浓度PRP(0%、10%、20%、30%)的诱导培养液作用于生长良好的已在钛片表面适应性生长24h的第4代BMSCs,每孔设3复孔,另设空白对照组。⑥成骨细胞鉴定:取第3代BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后,以碱性磷酸酶染色法及钙结节染色法验证其成骨分化能力。⑦MTT法检测增殖:分别在第1、4、7、10d取各孔实验组,弃去孔内培养液,清洗后加入MTT试剂于钛片上,37℃孵育4h,再加入二甲基亚砜,结晶均匀溶解后在酶标仪上测各标本的OD值。⑧ELISA法测PDGF-AB浓度:分别在第0、1、2、3、4d取各钛片组细胞的上清液,根据兔ELISA试剂盒说明检测各标本中PDGF-AB的OD值,并在标准曲线上获得PDGF-AB浓度。⑨荧光染色观察钛片表面细胞形态:在第4、7、10d取出各实验组钛片,固定后以荧光染色剂F-actin对细胞骨架进行荧光染色,再以DAPI最后复染细胞核,正置荧光显微镜下观察。 结果:①倒置显微镜下细胞形态:原代BMSCs呈短梭形,至12d左右可达到80%融合,此时细胞形态为均一的长梭形,漩涡状排列,传代后的细胞形态比原代细胞更为均一,增殖迅速。根据生长曲线图可知,传代培养潜伏期一般为2-3d,4-8d为对数生长期,9-10d增殖趋于稳定,达到平台期,细胞增殖趋于平缓。②成骨能力鉴定:经成骨诱导后,碱性磷酸酶染色结果示细胞胞浆中出现红棕色、棕褐色或咖啡色颗粒,钙结节染色示结节处有橘红色钙盐沉积,即为钙化结节,均呈阳性表达,表明所培养的BMSCs具备成骨分化能力,为成骨细胞。③PRP的检测:采用二次离心法得到的PRP中血小板数目为864±37×109/ml,是全血201±26×109/ml的4.3倍。PRP经激活后,析出的上清液经兔ELISA试剂盒检测PDGF-AB值在标准曲线上能获得值为95.537±5.112ng/ml,二次离心法制备的PRP中含有高浓度的生长因子PDGF-AB。④MTT检测增殖结果:20%PRP组第7d时OD值最高,在第4d20%>30%>10%,差异有统计学意义(P<0.05);第7-10d,20%>10%>30%,差异有统计学意义(P<0.05);0%对照组各时间点间无明显变化。因此增殖作用与PRP存在时间和浓度效应,20%为最佳作用浓度。⑤PDGF-AB浓度变化:PDGF-AB值总体趋势逐渐下降,受自分泌及旁分泌影响稍有波动,但前3d仍能维持较高浓度。第4天生长因子大量衰减,即表明该因子的有效作用时间为前3天。⑥荧光染色结果示:细胞核呈蓝色,圆形或椭圆形,细胞骨架呈绿色,形态不规则,多角形,可见突起,包绕在细胞核周围,符合成骨细胞形态。 结论:①本实验中各浓度(10%、20%、30%)PRP均能有效地促进BMSCs的增殖,其中20%PRP为最佳浓度。②二次离心法制备的PRP中含有高浓度的生长因子PDGF-AB,在PRP20%浓度时PDGF-AB所对应值为18.66-24.30ng/ml,为该因子作用于成骨细胞的最佳浓度范围。③PRP中生长因子PDGF-AB半衰期较短,前3天为最佳作用时间。


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