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脐带源间充质干细胞移植对慢性实验性结肠炎相关肝胆病变的治疗作用

牛国超  
【摘要】:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因不明的肠道炎症性疾病,是我国炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的主要临床形式之一。IBD患者常伴发一些肠外表现(extraintestinal manifestations, EIMs),肝胆病变是IBD常见的EIMs。据统计,肝胆病变是影响IBD病死率的重要因素之一。因此,研究IBD发病中相关的肝胆病变及其机制,对IBD的综合治疗具有重要意义。 众所周知,正常机体肠腔内含有大量细菌及内毒素,而IBD发病时因受损结肠黏膜的通透性升高,引起细菌和内毒素移位,继而导致内毒素血症。内毒素的本质是革兰阴性细菌细胞壁上的脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)成分,细菌裂解或粘附在其他细胞上时LPS释放出来。肝脏是清除肠源性细菌及内毒素的重要场所,越来越多的证据表明,LPS/Toll样受体4(Toll like receptor4, TLR4)信号转导通路在多种慢性肝病的发病机制中起关键作用。 TLR是天然免疫系统中识别病原微生物的主要受体,其中,TLR4在人体的固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用。TLR4是将LPS信号导入细胞内的表面受体,LPS是肝脏巨噬细胞(Kupffer细胞, KC)强的激活剂,KC被LPS激活后可以启动LPS/TLR4介导的炎症反应,导致肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)以及白介素-17A(interleukin-17A, IL-17A)等炎症细胞因子的产生从而引起肝胆病变。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞,可通过增强肠道上皮修复能力、减轻肠道炎症反应治疗IBD,对多种原因引起的肝损伤也具有显著缓解作用。鉴于上述机制,我们推断MSCs对IBD相关肝胆病变也有治疗作用。为此,本实验对人脐带来源的MSCs(human umbilical cord MSCs, hUC-MSCs)移植治疗慢性实验性结肠炎相关肝胆病变的作用及可能机制进行了初步研究。 目的:观察MSCs对慢性实验性结肠炎小鼠结肠黏膜炎症及相关肝胆病变的治疗作用与机制。 方法:①慢性实验性结肠炎模型通过饮用2%右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate, DSS)成功建立,1~5天、8~12天、15~19天、22~26天、29~33天和36~40天饮用2%的DSS,41、42天及其它时间饮用蒸馏水。随机分为正常对照组、DSS+Vehicle组、DSS+MSCs组,每组10只;DSS+MSCs组在造模第14天时经尾静脉注射1×10~6/200μL的hUC-MSCs,正常对照组与DSS+Vehicle组则给予等体积PBS作为对照。第43天处死动物。②结肠黏膜炎症改变的评估包括每天体重(Bodyweight, BW)改变、疾病活动指数(Disease activity index, DAI)、结肠长度等指标以及结肠大体形态学改变和组织病理学评分。③采用Haematoxylineosin staining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)方法观察肝脏病理学改变。④自动生化仪检测小鼠肝功能改变。⑤偶氮基质显色法检测血清中LPS含量。⑥对各组动物肠系膜淋巴结(Mesenteric lymphnodes, MLN)匀浆液进行细菌培养以明确有无大肠杆菌感染。⑦采用免疫组织化学染色、western blot和real-time Q-PCR方法检测各组小鼠肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor6, TRAF6)和核因子-κB(nuclear factorkappa B, NF-κB)蛋白及mRNA的表达。 结果:①与正常对照组相比,DSS+Vehicle组动物体重明显减轻,经MSCs治疗后,DSS+MSCs组动物体重较DSS+Vehicle组明显回升;与正常对照组相比,DSS+Vehicle组动物DAI增加(4.00±0.65vs0.00±0.00,P0.05),结肠长度明显缩短(3.93cm±0.22cm vs6.30cm±0.55cm,P0.05),结肠壁充血、水肿明显(2.75±0.50vs0.00±0.00, P0.05),结肠组织病理切片显示淋巴细胞及中性粒细胞明显浸润,可见多灶性浅溃疡,病理评分显著增加(11.80±0.96vs0.00±0.00, P0.05);而经过MSCs移植治疗后,DSS+MSCs组DAI较DSS+Vehicle组明显降低(0.30±0.46vs3.05±0.25, P0.05),同时结肠长度有所增长(5.18cm±0.73cm vs3.93cm±0.22cm, P0.05),结肠壁充血、水肿明显减轻(1.11±0.45vs2.75±0.50,P0.05),结肠组织病理切片结果显示淋巴细胞及中性粒细胞浸润明显减少,病理评分显著降低(5.0±0.62vs11.8±0.96, P0.05)。②肝脏组织HE和MT染色结果显示,与正常对照组相比,DSS+Vehicle组可见肝内汇管区胆管和胆管周围淋巴细胞及中性粒细胞明显浸润,肝细胞排列散乱,细胞水肿、胞浆疏松化,同时肝小叶汇管区内仍有少量纤维组织生成,有短的纤维间隔伸入肝小叶,未见纤维组织异常改变,病理评分显著增加(4.70±0.62vs0.00±0.00, P0.05),而经过MSCs治疗后,DSS+MSCs组淋巴细胞及中性粒细胞浸润明显减少,肝细胞变性损伤明显减轻,病理评分降低显著(2.56±0.40vs4.70±0.62, P0.05)。③血清肝功能检测显示,同正常对照组相比,DSS+Vehicle组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平明显升高(ALT:56.82U/L±10.40U/L vs34.50U/L±8.23U/L,P0.05; AST:104.25U/L±17.26U/L vs78.00U/L±10.40U/L, P0.05),白蛋白(albumin, ALB)水平明显降低(30.33U/L±1.21U/L vs38.60U/L±1.18U/L.P0.05),血清总胆红素(total bilirubin, TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)水平升高不明显(TBIL:3.08μmol/L±0.57μmol/L vs2.49μmol/L±0.55μmol/L, P0.05; DBIL:1.47μmol/L±0.27μmol/L vs1.05μmol/L±0.36μmol/L, P0.05);而给予MSCs治疗后,同DSS+Vehicle组相比,ALT、AST水平显著降低(ALT:46.00U/L±8.70U/L vs56.82U/L±10.40U/L,P0.05; AST:87.94U/L±13.51U/L vs104.25U/L±17.26U/L, P0.05),ALB水平显著升高(35.43U/L±2.43U/L vs30.33U/L±1.21U/L, P0.05),TBIL、DBIL水平降低不明显(TBIL:2.99μmol/L±0.70μmol/L vs3.08μmol/L±0.57μmol/L, P0.05; DBIL:1.24μmol/L±0.18μmol/L vs1.47μmol/L±0.27μmol/L, P0.05)。④与正常对照组相比,DSS+Vehicle组小鼠血清中LPS水平显著增加(0.19EU/mL±0.03EU/mL vs0.11EU/mL±0.01EU/mL, P0.05);而DSS+MSCs组小鼠血清中LPS水平较DSS+Vehicle组明显降低(0.15EU/mL±0.01EU/mL vs0.19EU/mL±0.03EU/mL,P0.05)。⑤正常对照组小鼠MLN匀浆液中无细菌移位(0%),与正常对照组相比,DSS+Vehicle组小鼠细菌移位率明显增加(90%),而DSS+MSCs组MLN细菌移位率较DSS+Vehicle组明显降低(15%)。⑥免疫组织化学染色检测结果显示:DSS+Vehicle组小鼠肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白表达水平,较正常对照组显著增加(TNF-α:0.79±0.07vs0.20±0.02, P0.05; IFN-γ:0.82±0.08vs0.15±0.01,P0.05; IL-1β:0.75±0.08vs0.10±0.01, P0.05; IL-17A:0.66±0.07vs0.12±0.01, P0.05; TLR4:0.72±0.08vs0.15±0.02, P0.05; TRAF6:0.61±0.06vs0.10±0.01, P0.05; NF-κB:0.67±0.08vs0.13±0.02, P0.05),而DSS+MSCs组TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白表达水平较DSS+Vehicle组明显下降(TNF-α:0.27±0.03vs0.79±0.08,P0.05; IFN-γ:0.41±0.05vs0.82±0.08, P0.05; IL-1β:0.35±0.04vs0.75±0.08, P0.05; IL-17A:0.35±0.04vs0.66±0.07, P0.05; TLR4:0.38±0.04vs0.72±0.08, P0.05; TRAF6:0.29±0.03vs0.61±0.06, P0.05;NF-κB:0.33±0.04vs0.67±0.08, P0.05)。⑦Western blot和real-time Q-PCR检测结果显示:与正常对照组相比,DSS+Vehicle组小鼠肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白和mRNA表达水平明显增加(蛋白:1.50±0.13vs1.05±0.05,1.86±0.10vs1.30±0.06,1.79±0.14vs1.11±0.07,1.51±0.07vs1.01±0.05,2.10±0.26vs1.48±0.17,1.77±0.18vs1.13±0.11,1.86±0.10vs1.42±0.09, P0.05; mRNA:1.94±0.14vs1.00±0.00,2.11±0.23vs1.00±0.00,2.03±0.19vs1.00±0.00,1.91±0.16vs1.00±0.00,2.46±0.23vs1.00±0.00,1.63±0.20vs1.00±0.00,1.84±0.13vs1.00±0.00, P0.05);而DSS+MSCs组与DSS+Vehicle组小鼠比较肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白和mRNA表达水平明显下降(蛋白:1.24±0.09vs1.50±0.13,1.43±0.15vs1.86±0.10,1.27±0.13vs1.79±0.14,1.28±0.07vs1.51±0.07,1.40±0.13vs2.10±0.26,1.36±0.15vs1.77±0.18,1.59±0.09vs1.86±0.10, P0.05; mRNA:1.39±0.17vs1.94±0.14,1.72±0.20vs2.11±0.23,1.33±0.17vs2.03±0.19,1.56±0.15vs1.91±0.16,1.61±0.17vs2.46±0.23,1.46±0.11vs1.63±0.20,1.49±0.19vs1.84±0.13, P0.05)。 结论:MSCs可减轻慢性实验性结肠炎结肠黏膜炎症及相关肝胆病变;其机制可能与MSCs能降低肠黏膜通透性、促进肠黏膜的修复、减少肠源性内毒素血症,从而下调LPS与TLR4介导的肝胆损伤有关。


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