莱菔硫烷对实验性自身免疫性脑脊髓炎髓鞘保护作用的病理学研究

【摘要】：目的：多发性硬化是一种中枢神经系统白质的炎性脱髓鞘性疾病。发病机制尚无定论,近年来多数学者认为,MS不仅是遗传易感个体与环境因素作用而发生的自身免疫过程,并且是一种神经变性过程,其造成的髓鞘和轴索不可逆性损伤是导致患者反复发作的神经功能障碍,多次缓解复发,病情每况愈下的主要原因。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是己被公认的MS的经典动物模型,其在病程上表现为急性发作、不缓解的慢性过程,很接近于人类MS的临床表现,是目前国际上公认较好的EAE模型之一。本研究应用MOG35-55建立EAE动物模型,用莱菔硫烷作为干预药物,通过透射电镜、罗克沙尔坚牢蓝(Luxol Fast Blue)特殊髓鞘染色从病理学和形态学两个方面来对比莱菔硫烷对EAE动物模型的髓鞘损伤是否有保护作用,通过HE染色定性观察莱菔硫烷对EAE动物模型是否有抗炎作用,通过olig2的免疫组织化学来观察莱菔硫烷是否可以通过提高olig2的表达发挥促进髓鞘再生,为多发性硬化的治疗提供新的治疗方向。 方法：本研究采用将72只8-12周龄健康C57BL/6雌性小鼠随机分为四组：正常对照组,EAE组、莱菔硫烷组、地塞米松组,除去正常对照组剩下的三组均用人工合成MOG35-55多肽与等量的含4mg/ml卡介苗的完全福氏佐剂(CFA)制成完全抗原皮下注入小鼠体内制作EAE动物模型,自免疫第1天(免疫当天记为0天)起,莱菔硫烷组每日腹腔注射50mg/kg/d,地塞米松组每日腹腔注射地塞米松注射液0.07mg/只,其他两个组隔日给予生理盐水O.1m1。观察药物对EAE大鼠发病的影响,参照通用的临床评分标准对大鼠进行神经功能评分。于免疫后第13天、20天、30天各组分别随机取材,取小鼠脊髓腰膨大部位的组织进行HE染色观察炎性细胞浸润和血管袖套形成情况,进行透射电镜和LFB髓鞘染色从病理学和形态学观察髓鞘脱失和轴索损伤情况,并进行olig2的免疫组织化学染色对比阳性细胞个数观察莱菔硫烷是否可以提高olig2的表达发挥促进髓鞘再生的作用。采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,发病率用百分数表示,组间比较采用卡方检验,计量资料以均数±标准差(x±S)表示,多组计量资料均数的比较应用ANOVA方差分析,组间两两比较采用LSD法,P0.05差异有统计学意义。 结果： 1动物发病情况观察：莱菔硫烷组发病率为33.33%,地塞米松组发病率27.78%,两组均显著低于EAE组(100%),差异均具有统计学意义(P0.05),莱菔硫烷组平均起病时间为(18.78±3.11)天,地塞米松组平均起病时间为(20.46±3.96)天,两组平均发病时间均较EAE组(13.42±4.12)显著延迟,差异均具有统计学意义(P0.05)；莱菔硫烷组平均最高神经功能评分(1.35±±1.34),地塞米松组平均最高神经功能评分(1.25±1.09),两组显著低于EAE组(2.82±1.14),差异均具有统计学意义(P0.05)。正常对照组无发病。 2HE染色： 2.1发病前期EAE组可见散在炎性细胞浸润,莱菔硫烷组和地塞米松组没有炎性细胞浸润。 2.2发病高峰期EAE组可见炎性细胞弥漫性浸润和大量“血管袖套”形成,莱菔硫烷组和地塞米松组“血管袖套”形成较少,炎性细胞主要集中于小血管周围。 2.3发病缓解期EAE组炎性细胞和“血管袖套”减少,莱菔硫烷组和地塞米松组炎性细胞更少,“血管袖套“消失。 2.4空白对照组各时期均没有炎性细胞浸润和“血管袖套”形成。 3透射电镜： 3.1发病前期EAE组脊髓腰膨大白质内可见髓鞘排列松解,形状不规则,莱菔硫烷组和地塞米松组未见明显的髓鞘和轴索的结构变化； 3.2发病高峰期EAE组髓鞘呈松散的层状结构,排列也极为松散,部分髓鞘崩解,断裂,脱失,轴索萎缩变性,结构不清晰；莱菔硫烷组和地塞米松组可见髓鞘排列松散,少量的髓鞘崩解脱失现象,少量轴索萎缩变性,结构尚清晰。 3.3发病缓解期EAE组髓鞘排列较发病高峰期更为松散,大量轴索萎缩变性,看不清边界,莱菔硫烷组和地塞米松组髓鞘排列较发病高峰期紧密,轴索结构较前清晰。 3.4正常对照组各时期髓鞘排列紧密,轴索结构清晰。 4LFB染色：EAE组发病前期无明显的髓鞘脱失区,可见部分髓鞘变薄,发病高峰期可见大小不等的片状脱髓鞘区,脊髓白质内的蓝色髓鞘区域减少,甚至可见空泡样变性,缓解期较高峰期无明显变化；莱菔硫烷组和地塞米松组发病前期无明显的髓鞘脱失,没有见到白色脱髓鞘区域；发病高峰期可见部分髓鞘变薄,些许小的髓鞘脱失区,缓解期较高峰期髓鞘变粗,蓝色髓鞘区域有所增加。正常对照组各时期均无脱髓鞘区。 5olig2免疫组织化学： 5.1发病前期：EAE组免疫阳性细胞平均数目为(8.62±1.14),莱菔硫烷组免疫阳性细胞平均数目为(19.63±2.70),地塞米松组免疫阳性细胞平均数目为(40.00±4.00),莱菔硫烷组和地塞米松组免疫阳性细胞平均数目均较EAE组免疫阳性细胞平均数目显著增加,差异均有统计学意义(P0.05)。 5.2发病高峰期：EAE组免疫阳性细胞平均数目为(13.82±1.48),莱菔硫烷组免疫阳性细胞平均数目为(18.43±1.82),地塞米松组免疫阳性细胞平均数目为(28.61±1.52),莱菔硫烷组和地塞米松组免疫阳性细胞平均数目均较EAE组免疫阳性细胞平均数目增多,差异均具有统计学意义(P0.05)。 5.3发病缓解期：EAE组免疫阳性细胞平均数目为(27.81±1.92),莱菔硫烷组免疫阳性细胞平均数目为(22.02±2.01),地塞米松组免疫阳性细胞平均数目为(17.6±1.14),EAE组免疫阳性细胞平均数目较莱菔硫烷组、地塞米松组免疫阳性细胞平均数目均均显著增多,差异均具有统计学意义(P0.05)。 结论： 1莱菔硫烷可以延迟EAE的起病时间,降低发病率,减轻神经功能损伤的程度。 2莱菔硫烷可以减轻EAE动物模型的炎性浸润,减少过度的炎性刺激造成的髓鞘的大面积脱失,促进髓鞘再生,及时恢复轴索的完整性,恢复神经的传导功能。 3莱菔硫烷于发病早期olig2即大量表达,EAE组olig2发病早期表达较少晚期才大量表达,莱菔硫烷可能通过早期大量促进olig2的表达发挥促进髓鞘再生的作用,病情得到缓解,而EAE组因为olig2大量表达时间晚不能及时促进髓鞘再生恢复髓鞘和轴索的功能,造成髓鞘和轴索不可逆性损伤,病情逐渐加重。