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降钙素对大鼠膝关节骨性关节炎潜在保护作用及其机制

程潭  
【摘要】:第一部分:降钙素对前交叉韧带切断大鼠膝关节软骨退变的影响 目的:探讨早期应用降钙素(calcitonin, CT)干预对前交叉韧带切断(anterior cruciate ligament transection, ACLT)导致的大鼠不稳定膝关节骨关节炎(osteoarthritis, OA)模型中的关节软骨退变的影响。 方法:将30只3月龄SPF级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,随机分为三组,每组10只动物,即:假手术组(Sham)、前交叉韧带切断+盐水(normal saline, NS)组(ACLT+NS)和前交叉韧带切断+降钙素组(ACLT+CT)。ACLT+NS组和ACLT+CT组大鼠于右膝关节行ACLT术,术后ACLT+CT组中大鼠给予CT5IU/kg/2d皮下注射,ACLT+NS组中大鼠给予等容量NS皮下注射,Sham组中大鼠只做膝关节腔打开而不行前交叉韧带切断,术后给予等容量NS皮下注射。造模术后12周处死各组动物,打开右膝关节腔后,观察各组大鼠膝关节软骨面并拍照记录。去除右侧股骨软组织后,用70%酒精固定大鼠股骨样本,固定72小时后采用EDTA-2Na制成脱钙液进行脱钙处理,约6周后待钙盐彻底脱失骨组织变软,然后行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋切片,将厚度约为6-8μm的骨组织石蜡切片分别行番红-O/快绿(safranin-O/fast green)及苏木素/伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,用于关节软骨组织形态学观察,同时采用Mankin评分方法定量分析关节软骨损伤情况;采用免疫组化方法检测各组大鼠膝关节软骨中Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen)、蛋白多糖分解酶-4(a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motifs-4, ADAMTS-4)及基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3, MMP-3)表达情况,应用Image pro-Plus6.0软件对免疫组化阳性蛋白表达情况进行积分光密度(integrated optical density, IOD)计算,定量分析各组大鼠膝关节软骨阳性细胞表达差异。 结果: 1.大鼠膝关节软骨表面大体观察发现:Sham组大鼠膝关节软骨面光滑完整;而ACLT+NS组因行ACLT术,12周后观察可见大鼠膝关节软骨面晦涩,可见关节面明显破溃,关节周围可见较大骨赘形成;而给予CT干预大鼠膝关节软骨面显粗糙,偶见小破溃,关节周围亦有较小骨赘形成。 2.关节软骨safranin-O/fast green、HE染色形态学观察发现:Sham组大鼠关节软骨面完整,软骨与软骨下骨界限清晰,基质着色均匀一致,细胞排列有序;ACLT+NS组术后12周大鼠关节软骨关节面严重破坏,软骨与软骨下骨界限模糊不清,基质着色不均,细胞呈团簇状克隆增殖,且分布不均,软骨细胞数目明显减少;ACLT+CT组大鼠软骨表面可见小裂隙存在,软骨与软骨下骨界限较为清楚,基质着色较为均一但着色略显变浅,细胞排列亦稍显紊乱。 3.关节软骨损伤Mankin评分显示:ACLT+NS组Mankin评分显著高于Sham组,差异具有统计学意义(P0.05),ACLT+CT组Mankin评分显著低于ACLT+NS组,差异具有统计学意义(P0.05),ACLT+CT组Mankin评分则明显高于Sham组,差异具有统计学意义(P0.05)。 4.关节软骨免疫组化检测显示:ACLT+CT组和ACLT+NS组大鼠软骨Ⅱ型胶原表达显著低于Sham组,而两组ADAMTS-4和MMP-3表达则明显高于Sham组,差异具有统计学意义(P0.05);ACLT+CT组大鼠关节软骨Ⅱ型胶原表达显著高于ACLT+NS组,而ADAMTS-4和MMP-3表达则明显低于ACLT+NS组,差异具有统计学意义(P0.05)。 小结:在ACLT诱导不稳定膝关节OA大鼠动物模型中,早期应用CT皮下注射能够刺激软骨细胞Ⅱ型胶原合成,同时抑制ADAMTS-4和MMP-3表达,减轻由膝关节不稳定造成的OA大鼠膝关节软骨损伤。 第二部分:降钙素对前交叉韧带切断大鼠膝关节软骨下骨作用 目的:降钙素(calcitonin, CT)作为一种骨转换调节剂而被用于骨代谢疾病的预防与治疗中。本实验在大鼠膝关节前交叉韧带切断(anterior cruciate ligament transection, ACLT)动物模型基础上,早期给予CT进行干预,观察CT对大鼠膝关节软骨下骨BMD及骨组织形态结构的影响。 方法:30只3月龄SPF级雄性SD大鼠被随机分为三组,每组10只动物,分别为:假手术组(Sham),即只做大鼠右膝关节腔切开而不对前交叉韧带进行切断术;前交叉韧带切断+盐水(normal saline, NS)组(ACLT+NS)和前交叉韧带切断+降钙素组(ACLT+CT)(?)(?)大鼠右膝关节打开并切断前交叉韧带,从而造成大鼠膝关节的不稳定状态。造模术后的ACLT+CT组大鼠即给予CT5IU/kg/2d皮下注射,ACLT+NS组和Sham组大鼠给予等容量NS皮下注射。12周后应用过量水合氯醛腹腔注射处死各组动物,处死前10天和前4天对所有动物依据体重分别给与四环素(25mg/kg)及钙黄绿素(5mg/kg)皮下注射。仔细去除右后肢肌肉等软组织后,应用双能骨密度测量仪分别测量大鼠膝关节股骨软骨下骨内侧髁和外侧髁骨密度(bone mineral density, BMD)。将右侧胫骨置于70%酒精溶液中固定约72小时,然后经梯度酒精脱水、二甲苯透明后,将右膝关节胫骨置于甲基丙烯酸甲酯溶液中进行硬组织包埋,在硬组织切片机上将每个样本包埋块制成厚度约为7-8μm切片两张,其中一张采用Gemisa试剂进行染色,另一张不行任何染色,分别用于计算软骨下骨骨小梁结构数据:相对体积(bone volume/trabecular volume, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)及骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp),骨小梁动态数据包括矿化相对面积(mineral surface, MS/BS)、矿化形成率(mineral apposition rate,MAR)及骨形成率(bone formation rate, BFR/BS)。大体观察软骨下骨形态并采用IPP软件对软骨下骨骨小梁结构进行组织形态计量学测定,定量分析软骨下骨结构参数与动态参数。 结果: 1.大鼠右侧膝关节股骨软骨下骨BMD检测发现:ACLT+NS组大鼠内、外侧髁软骨下骨BMD较Sham组大鼠显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);CT干预ACLT术后大鼠其内、外侧髁软骨下骨BMD显著高于ACLT+NS组,差异具有统计学意义(P0.05),而与Sham组比较,ACLT+CT组大鼠的内、外侧髁软骨下骨BMD显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。 2.大鼠右侧膝关节胫骨软骨下骨骨组织形态计量学结构参数检测发现:ACLT+NS组大鼠软骨下骨BV/TV. Tb/Th和Tb/N值较Sham组大鼠显著降低,而Tb.Sp值较Sham组中大鼠则显著升高,差异具有统计学意义(P0.05):CT干预ACLT术后大鼠其软骨下骨BV/TV、 Tb/Th和Tb/N值显著高于ACLT+NS组中大鼠,而ACLT+CT组大鼠Tb.Sp值较ACLT+NS组中大鼠显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);与Sham组比较,ACLT+CT组大鼠其软骨下骨BV/TV、Tb/Th和Tb/N值显著降低,而Tb.Sp值显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。 3.大鼠右侧膝关节胫骨软骨下骨骨组织形态计量学动态参数检测发现:ACLT+NS组大鼠软骨下骨MS/BS、MAR和BFR/BS值较Sham组大鼠显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);CT干预ACLT术后大鼠软骨下骨MS/BS、MAR和BFR/BS值显著高于ACLT+NS组,差异具有统计学意义(P0.05);而ACLT+CT组软骨下骨MS/BS、MAR和BFR/BS值显著低于Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。 小结:CT能够抑制ACLT诱导的大鼠OA早期膝关节软骨下骨骨量丢失,改善软骨下骨骨小梁微观结构,进而维持软骨下骨生物力学性能。 第三部分:MAPK信号蛋白在降钙素抑制由白介素-1β诱导的软骨细胞基质金属蛋白酶-13表达中的作用 目的:降钙素(calcitonin, CT)显示出一定的软骨细胞保护作用,本实验旨在探讨CT是否能够影响MAPKs信号通路,进而抑制由IL-1β诱导的软骨细胞MMP-13表达。 方法:取自1月龄SPF级SD大鼠的膝关节表面软骨组织,经酶消化后培养软骨细胞,于第2代软骨细胞用于实验,共分为6组,①空白组(control):给予DMEM培养液孵育24h+15min;②IL-1β组(IL-1β):于DMEM培养基中孵育24h,然后加入10ng/ml IL-1β再孵育15min;③CT低剂量(Low dosage CT=L)预处理组(L+IL-1β):先在含CT50ng/mlDMEM培养基中孵育24h,然后加入10ng/ml IL-1β再孵育15min;④CT高剂量(High dosage CT-H)预处理组(H+IL-1β):先在含CT500ng/mlDMEM培养基孵育24h,然后加入10ng/ml IL-1β再孵育15min;⑤CT低剂量对照组(L):在含CT50ng/ml DMEM培养基24h+15min;⑥CT高剂量对照组(H):给予含CT500ng/ml DMEM培养基24h+15min。免疫细胞化学方法检测软骨细胞中磷酸化p38(phospho-p38)、磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2)、磷酸化JNK (phospho-JNK)及MMP-13表达;Western blot方法分别检测软骨细胞中磷酸化及总p38(phospho-p38, total p38)、ERK1/2(phospho-ERK1/2, total ERK1/2)、 JNK (phospho-JNK, total JNK)及MMP-13蛋白表达情况。应用IPP软件对各组Western blot条带蛋白表达进行积分光密度(integrated optical density, IOD)计算,定量分析各组不同检测指标蛋白表达差异。 结果: 1.软骨细胞免疫化学检测显示:与control组比较,IL-1β显著刺激软骨细胞MMP-13表达,同时上调phospho-p38、phospho-ERK1/2和phospho-JNK表达;而CT预处理的软骨细胞经IL-1β孵育后,其MMP-13、phospho-p38和phospho-ERK1/2的阳性染色表达较IL-1β单纯处理组软骨细胞阳性染色变弱,但不同剂量CT预处理后,两组间MMP-13、phospho-p38和phospho-ERK1/2P(?)性着色未见显著差别;与control组比较,不同剂量CT单独预处理后,软骨细胞MMP-13、phospho-p38、 phospho-ERK1/2和phospho-JNK表达未见显著差别。 2.软骨细胞VWestern blot检测显示:IL-1β单纯处理组较control组,其MMP-13、phospho-p38、phospho-ERK1/2和phospho-JNK的蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P0.05),而total p38、total ERK1/2、 total JNK的蛋白表达与control组比较,差异无统计学意义(P0.05);CT预处理的软骨细胞经IL-1β孵育后,其MMP-13、phospho-p38和phospho-ERK1/2的蛋白表达较IL-1β单纯处理组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),而total p38、total ERK1/2、total JNK、phospho-JNK和total JNK的蛋白表达与IL-1β单纯处理组比较,差异无统计学意义(P0.05);高低不同剂量CT对phospho-p38, phospho-ERK1/2及MMP-13蛋白表达调控作用并无剂量依赖性(P0.05);与control组比较,高低不同剂量CT对正常软骨细胞MMP-13和MAPKs(p38、ERK1/2和JNK)均无影响(P0.05)。 小结:应用CT对软骨细胞进行预处理能够抑制IL-1β诱导的软骨细胞MMP-13表达,同时CT可能通过调控MAPKs通路中phospho-p38和phospho-ERK1/2表达进而下调软骨细胞中MMP-13合成。 结论:早期给予降钙素干预能够减轻实验性OA模型大鼠膝关节软骨损伤,同时也能够保护软骨下骨骨组织微结构,延缓OA病程进展,具有潜在的OA治疗作用。


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