胰岛β细胞系中SHIP2表达及多态性与2型糖尿病的关系研究

【摘要】：糖尿病是由多种原因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病。全球糖尿病的患病人数逐年增加,2010年已超过2亿,目前我国糖尿病患者已经超过4千万,其中2型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)患者占到90%以上。 随着分子生物学及临床医学研究的不断进步,近年来对T2DM发病机制的研究有了很大进展,尤其是在胰岛素抵抗和胰岛p细胞功能障碍这两个方面,从而为T2DM的诊断和治疗做出了很大贡献。肥胖作为T2DM发生和发展中最主要的危险因素之一,显著特征是患者体内游离脂肪酸水平(Free fatty acid, FFA)持续升高；血浆FFA浓度的升高不仅可以增加周围组织的胰岛素抵抗,同时还能损害p细胞功能,抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)和p细胞增殖,诱导p细胞凋亡,降低p细胞数量,最终导致糖尿病的发生发展。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, pI3K/Akt)通路是胰岛素主要的信号传导通路。SHIP2基因是目前新发现的一种磷酸酶,是PI3K/Akt信号通路的负调控因子。有关SHIP2基因在胰岛素分泌及糖尿病发病中的作用,尤其是有关临床方面的研究国内外尚无报道。本研究拟检测SHIP2基因在胰岛p细胞中的表达,探讨SHIP2基因对胰岛p细胞胰岛素分泌的作用及其多态性和2型糖尿病的关系。共分三部分：(1)RT-PCR及Western blot检测棕榈酸(Palmitate acid, PA)干预的胰岛p细胞中胰岛素分泌及SHIP2基因表达的变化；(2)应用干扰RNA技术封闭胰岛p细胞系中SHIP2基因后观察SHIP2基因沉默对胰岛p细胞胰岛素分泌功能及Akt磷酸化水平的变化来了解SHIP2在影响细胞增殖中的机制；(3)利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术检测SHIP2基因的SNP3和SNP5两个基因型,探讨SHIP2基因多态性与2型糖尿病的相关性。 第一部分游离脂肪酸干扰胰岛pTC3后SHIP2表达及生物学意义 目的：探讨FFA诱导p细胞损伤的机制,并以棕榈酸作为诱导因素建立游离脂肪酸诱导的p细胞损伤模型,检测SHIP2基因在FFA诱导p细胞损伤中的表达变化。 方法：应用不同浓度(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L)的棕榈酸处理p细胞,构建FFA诱导p细胞凋亡模型。利用MTT检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学和Western blot检测p细胞中SHIP2蛋白的表达,RT-PCR检测棕榈酸处理后SHIP2mRNA表达变化,放免法检测棕榈酸干预后胰岛p细胞的胰岛素分泌变化。 结果： 1MTT结果显示,以不同浓度棕榈酸干预的p细胞表现为增殖受抑,增殖指数减低,与未干预组相比有统计学差异(P0.01)。且随棕榈酸干预浓度增加,p细胞增殖率逐渐降低,且其作用呈剂量依赖性。 2流式细胞术检测结果显示,对照组p细胞的凋亡率为(3.03±0.03)%；0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L的棕榈酸作用24h后pTC3细胞凋亡率分别为(4.97±0.14)%、(11.07±0.48)%、(22.43±1.01)%,即随着作用浓度的升高凋亡率逐渐增加,且明显高于对照组,各组间相比差异有统计学意义(P0.05)。 3Western blot分析结果显示,与对照组相比,棕榈酸干预的p细胞SHIP2蛋白表达增加,且随着棕榈酸浓度升高,SHIP2蛋白表达逐渐增强(P0.05)。免疫细胞化学分析发现,SHIP2表达于p细胞胞浆,呈棕黄色颗粒状；未处理组表达较弱。棕榈酸干预后,随干预浓度增加p细胞胞浆内SHIP2表达逐渐增强。 4RT-PCR结果表明,与对照组相比,棕榈酸处理后,p细胞中SHIP2mRNA的表达水平上升,并且随着药物作用浓度增加而升高,提示棕榈酸可诱导p细胞SHIP2mRNA表达,SHIP2：mRNA表达水平与棕榈酸剂量呈现量效关系。 5棕榈酸干预组p细胞p-Akt473水平明显低于未处理组,差异有统计学意义(P0.05)。且随着棕榈酸干预浓度升高,p-Akt水平逐渐降低,呈剂量依赖性。Akt表达水平在各组间无统计学差异(P0.05)。 6放免法检测胰岛素浓度,结果显示,p细胞经不同浓度的棕榈酸孵育24h后,2.8mmol/L葡萄糖刺激的胰岛素分泌随棕榈酸干预浓度升高逐渐增加,而22.4mmol/L葡萄糖刺激的胰岛素分泌随棕榈酸干预浓度升高逐渐减少,提示胰岛素分泌与棕榈酸浓度呈现出剂量依赖性。 结论：棕榈酸明显抑制胰岛p细胞增殖,促进其凋亡,降低葡萄糖刺激胰岛p细胞的胰岛素分泌；其机制可能通过增强SHIP2蛋白表达,抑制Akt磷酸化。 第二部分SHIP2基因在胰岛p细胞中表达变化的机制探讨 目的：通过RNA干扰技术沉默胰岛p细胞SHIP2基因,观察胰岛p细胞在SHIP2基因缺失后其生物学效应的变化并探讨其机制。 方法：检测p细胞目的基因SHIP2表达并进行转染条件优化；设计和合成三条Stealth siRNA片段,通过QPCR方法检测Stealth siRNA对靶基因的干扰效果,Western blot检测SHIP2蛋白进行转染鉴定；实验分为三组：A组：βTC3、B组：βTC3+脂质体-Lipo2000复合物和C组：βTC3+脂质体-Lipo2000复合物+Stealth siRNA-2,MTT检测胰岛p细胞的增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡变化,Western blot检测各组细胞SHIP2、p-Akt473及Akt表达变化,放免法检测2.8mmol/L和22.4mmol/L两种浓度葡萄糖刺激后各组胰岛素的分泌情况。 结果： 1SHIP2基因在βTC3细胞中有表达。Oligo转染靶细胞后24h,F组(Oligo:Lipo2000为25pmol:1.5μl)的荧光比例相对较高,I组(Oligo:Lipo2000为50pmol/1.5μl)荧光比例与F组相当,但是转染后部分细胞死亡,因此选择F组的转染条件Oligo:Lipo2000为25pmol:1.5μl作为后续实验条件。 提取转染siRNAs24h后各组细胞的总RNA,用QPCR测定SHIP2基因表达情况。与对照组相比,siRNA-1、2、3组pTC3细胞SHIP2mRNA表达经bandscan扫描分析基因沉默效率分别为-523%、46.6%和-97.2%,其中以siRNA-2组干扰有效果；内参GAPDH mRNA表达各组基本相同。 2与对照组相比,空载体转染组SHIP2蛋白的表达未见明显变化,而SHIP2siRNA-2组SHIP2蛋白表达水平明显下降。 3SHIP2基因沉默促进p细胞增殖MTT检测表明：C组与A、B两组相比较,转染后p细胞增殖明显增加,其作用随着作用时间延长而增强,转染48h促进细胞生长作用达高峰,这种促增殖作用持续到转染后72h。而B组和A组细胞仍增殖缓慢,它们和C组的差异加大,曲线分离加剧。(P0.05)。 1SHIP2基因沉默对p细胞凋亡的影响流式细胞学检测凋亡发现C组TC3细胞48h的凋亡率为(3.89±0.023)%,略低于A组[(3.91±0.021)%]和B组[(3.98±0.025)%],但无统计学差异(P0.05)。 2SHIP2基因沉默p细胞Akt磷酸化水平变化,Western blot结果显示,磷酸化Akt473表达水平在C组较A、B两组表达明显增高(P0.05),A和B组之间无统计学差异(P0.05),总AkT的蛋白表达水平在三组间无统计学差异(P0.05)。 32.8mmol/L浓度葡萄糖的KRB缓冲液孵育后p细胞胰岛素分泌在三组之间没有差异(P0.05)。22.4mmol/L浓度葡萄糖的KRB缓冲液孵育后各组均产生了高糖刺激后的胰岛素分泌,C组的胰岛素分泌量增加,与A、B组比较有统计学差异(P0.01)。A组与B组之间比较无统计学差异(P0.05)。 结论：针对SHIP的干扰RNA能有效抑制p细胞中SHIP2基因的表达；SHIP2基因沉默导致胰岛p细胞中Akt磷酸化水平上调,p细胞增殖能力增强,胰岛素分泌增加；SHIP2基因表达受抑不能使pTC3细胞的凋亡率有显著降低。 第三部分SHIP2基因多态性和2型糖尿病的相关性研究 目的：本研究基于河北地区汉族人群的遗传背景,研究探讨SHIP2基因SNP3(+1893/1894AA/CC)和SNP5(+2945A／G)与2型糖尿病的相关性,探索SHIP2基因与2型糖尿病发关系。 方法：选取符合1999年世界卫生组织(WHO)糖尿病诊断标准的河北医科大学第二医院的2型糖尿病住院患者376例；正常健康人(设立对照组)382例。所有人群对本次研究知情同意并自愿参加,采取外周静脉血应用基因柱吸附法提取DNA,利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测SHIP2基因SNP3和SNP5两个基因型,计算其基因型分布及等位基因频率并进行比较。 结果： 1Hardy-Weinberg平衡检验对病例组和对照组的基因型频数分布分别进行拟和优度χ2检验,结果表明：各位点基因型在各组中的频数分布均符合H-W平衡定律(P0.05)。 2SHIP2基因多态性在T2DM组与对照组中基因型和等位基因的频数分布： 2.1SHIP2基因SNP3(+1893CC/AA)位点在T2DM组／正常对照组中的分布为：AA型23/13(6.1%/3.4%)；CC型273/315(72.6%/82.5%)；CA型80/54(21.3%/14.1%)；A和C等位基因在T2DM组／正常对照组中的分布为：A等位基因146/80(18.9%/10.5%)；C等位基因626/684(81.1%/89.5%)；各基因型频率和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(均P0.05)SNP3位点AA、CC、AC基因型在T2DM患者组和正常对照组之间的差异有统计学意义(χ2=10.78,P=0.00)；等位基因频率分布经χ2检验在两组之间的差异有统计学意义(χ2=21.80,P=0.00)； 2.2SHIP2基因SNP5位点经χ2检验在T2DM患者组和正常对照组之间差异无统计学意义(χ2=2.42、P=0.30,χ2=3.21、P=0.07)。 3各基因型间在T2DM组与对照组临床表型特征的比较： 3.1SNP3单因素方差分析,对照组内CC基因型较CA、AA基因型在腰臀比(WHR)水平差异有统计学意义(均P0.05),其余临床指标差异无统计学意义(均P0.05)。 3.2SNP5单因素方差分析,对照组中AA基因型在体重指数水平上较GG型明显下降,且有统计学意义,其余指标差别均无统计学意义。 4T2DM组中高血压组与非高血压组各基因型与等位基因频率分布： SHIP2基因SNP3(+1893CC/AA)基因型分布：CC型195/142(88.6%/91.0%)、CA型24/12(10.9%/12%)、AA型1/2(0.5%/2%)三个基因型间无差别(χ2=1.828,P=0.401)。等位基因C为414/296(94.1%/94.9),等位基因A为26/16(5.9%/5.1%),两者之间无差别(χ2=0.211,P=0.646)。各基因型与高血压可能无关。 结论： 1T2DM组与正常对照组中SHIP2基因SNP3(+1893CC/AA)各基因型和等位基因频率在两组间差别有统计学意义,提示其可能是糖尿病的保护因素。 2SHIP2基因+2945A/G各基因型和等位基因频率差别无统计学意义,结果提示SHIP2基因+2945A/G多态性可能与2型糖尿病无相关性,提示SHIP2基因+2945A/G多态性与2型糖尿病无相关性。 3SHIP2基因+2945A/G,携带G等位基因的2型糖尿病患者易发生高血压。