VEGF在脊髓空洞前状态中的表达及作用机制探讨

【摘要】： 目的：本研究通过枕大池注射Kaolin制作脊髓空洞症的动物模型，应用干湿法测定脊髓空洞前状态中脊髓含水量进行定量研究并观察其变化趋势；应用免疫组织化学、酶联免疫吸附实验(ELISA)，检测脊髓组织和脑脊液中VEGF的表达及变化趋势，探讨VEGF与空洞前状态中脊髓水肿形成之间的关系及其作用机制。 方法：将40只健康、体重1.5-2kg的中国白兔(雌雄不限)，随机分为三组。其中Kaolin组20只，生理盐水组10只，假手术组10只。家兔在氯胺酮(30mg／kg)耳缘静脉麻醉后，取俯卧颏低位，颈后部备皮常规消毒。按McLaurin法行经皮枕大池穿刺术，缓慢抽出无色透明脑脊液0.6ml后，Kaolin组动物注入37℃25％Kaolin悬浊液0.6ml；依同样方法生理盐水组动物仅注入37℃生理盐水0.6ml；假手术组动物只行枕大池假穿刺，既不注射Kaolin，也不注射生理盐水以作对照。于术后第1、3、7、14、21天，随机选取动物再次麻醉行枕大池穿刺，穿刺针方向朝向第四脑室，缓慢取出CSF0.6ml后断头处死，离心5分钟(2500转／min)取上清液-40℃低温保存，行ELISA检测其中VEGF含量，与动物模型制作时经枕大池穿刺采集的脑脊液进行自身正常对照。动物处死后，迅速完整取出脑和颈髓组织，于C_(1-2)节段取4mm，仔细剔除表 中文摘要 面蛛网膜及 Kao i n沉积，滤纸吸除表面水分，用电子大 平（分度值O．00019）称取湿重仰，再经no℃恒温烤箱 烘烤24 小时后称取干重①厂 应用公式：脊髓含水量 恍广仰－D）／W X 100，计算脊髓含水量。其余标本 4％多聚甲醛固定48小时，制作蜡块、切片，进行H＆E染 色和免疫组织化学染色。用 HPIASq 高清晰度彩色病 理图文分析系统对免疫组织化学染色阳性反应物进行定 量检测，测定切片中阳性反应物的面积和灰度，数据通过 t检验进行统计学处理。观察各组动物脊髓组织中VEGF的 表达及变化趋势，并与脊髓水肿变化趋势进行对比。 结果：术后第l上天，Kaolin组动物表现出精神萎 靡，嗜睡，厌食；于7八 天症状逐渐加重，出现肢体无 力，轻瘫及运动协调性差等神经功能障碍，并伴有明显消 瘦，其中2只因处于濒死状态而处死；3周后精神、食欲 明显好转，但神经缺失症状无明显改善，且有逐渐加重的 趋势。生理盐水组和假手术组动物在观察期间则表观正 常。标本肉眼观察，生理盐水组和假手术组动物脑、脊髓、 蛛网膜下腔和中央管等外观正常。Kaolin组动物的脑脊髓 标本在第1天无明显变化，仅见下位脑干至上颈髓背、腹 侧蛛网膜下腔有大量Kaolin沉积，四脑室正中孔和侧孔 被不同程度阻塞；第3大除上述变化外，出现脑组织肿胀、 脊髓水肿增粗；第7、14天水肿最为明显，枕大池狭窄或 闭塞，四脑室轻度扩张；第ZI天水肿较前缓解，但四脑 室扩张较前加重，小脑扁桃体轻度下疵；中央管饱满、扩 张。Kaolin肉芽肿形成，与蛛网膜下腔和脊髓粘连，不易 剥离。干湿法测定脊髓含水量结果显示，假手术组和生理 2 中文摘要 盐水组家兔脊髓含水量无明显统计学差异，其均值分别为 67．66士 0．82O和 67．15士 0．70o；Kaolin组动物脊髓含水 量在术后第1大轻度升高K8．35士0．7％人 第3天水肿明 显力重（72．70士0．88o），第 7、14天达至高峰（72．92士 0．86％、刀．18b 0．55％），第ZI天水肿开始缓解，但仍高 于正常门0．03切．77人 Kaolin组动物脊髓含水量与生理盐 水组和假手术组比较有明显差异。光镜观察，正常和生理 盐水对照组动物脊髓神经元轮廓正常，核及核仁清楚，胞 浆内尼氏体分布均匀，神经元、神经胶质细胞、血管周围 间隙正常。他dn组动物术后第1天，脊髓组织学检查 亦无明显改变；第3天出现细胞、血管周围间隙增宽，表 现为轻度水肿；第7天、14天水肿程度加重，核膜、核 仁稍显模糊，神经元胞体内尼氏体减少，胶质细胞增生， 中央管饱满，中央管室管膜细胞受压变平，管周组织疏松， 呈明显水肿改变，蛛网膜下腔可见 Kao i n沉积，大量炎 性细胞浸润。第ZI大水肿稍显减轻，但持续存在，胞浆 空泡出现，后角细胞数量减少，胶质细胞增生明显，中央 管张力增加，室管膜上皮断裂，可见 Kao i n肉芽肿形成。 免疫组织化学检测，生理盐水组和假手术组动物颈髓灰质 神经元有VEGF弱阳性表达，微血管壁和室管膜上皮 VEGF表达阴性。Kaolin组动物颈髓组织于术后第1天神 经元VEGF表达有明显升高，神经胶质细胞亦可见阳性表 达；第 3大、7天、14天 VEGF在神经元、神经胶质细胞 以及白质中星型胶质细胞呈强阳性表达，胞浆可见粗的棕 黄色颗粒分布，同时可见软膜和髓内血管壁呈VEGF阳性 表达。第 ZI天 VEGF表达明显减弱，仅在神经元和神经