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丹参单体IH764-3对肝纤维化大鼠胶原降解作用的研究

王占魁  
【摘要】: 目的:肝纤维化是一种慢性进行性疾病,特点为细胞外间质(extracellular matrix,ECM)合成增加并沉积于组织间隙,伴有肝实质细胞损伤。虽然肝纤维化的机制尚未完全明了,但是胶原合成和降解失衡是其中的关键因素。最近的研究表明:纤维化肝脏胶原降解能力下降,其主要原因是金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase,TIMPs)-1和-2水平升高,其中以TIMP-1最为重要。而转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGFβ 1)可以上调TIMP-1的表达,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)则是TIMP-1和TGFβ1的主要来源。 据报道,丹参、丹参提取物、丹参的活性成分及以丹参为主要成分的组方可以防治肝纤维化,丹参单体IH764-3是丹参的一种活性成分,可以防治CCl_4诱发的大鼠肝纤维化,其机制之一是抑制HSCs增殖和胶原合成从而防止细胞外间质沉积。有关IH764-3对胶原降解作用的研究很少,亦不了解其对HSCs和胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)肝纤维化动物模型TIMP-1及TGFβ1的影响。本实验的目的就是利用体内和体外研究的方法观察IH764-3对胶原降解的作用。 方法:应用胆总管结扎的方法建立大鼠胆汁性肝纤 中文摘要 维化模型。对照组行假手术,即只游离胆总管不结扎。 模型组和IH764习组双结扎并剪断胆总管。40只清洁级 雄性Sprague Dawley大鼠随机分为3组即对照组(假手 术组)10只、模型组(手术组)15只以及 IH764I组(手 术刊H764上 组)15只。将 IH764I 用生理盐水稀释成 sg吮”’,自手术当日开始,按40mg吐g’‘的剂量,每日腹 腔注射1 次;其他两组分别注射相应剂量的生理盐水。 实验共进行14天,于手术第7天测动物体重,分别调整 IH7643和生理盐水的剂量。实验结束后,处死全部动物, 取部分肝组织j0 oC冻存,以备羟脯氨酸测定;另一部分 肝组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,用于HE和Masson 三色染色以及TI衅J、TGF pl 免疫组织化学染色,采 用病理图象分析仪测量阳性面积。 肝星状细胞株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠 赠,其表型为活化的HSCS,从CCI。诱发的肝硬化大鼠 中分离。HSCS复苏后接种于含小牛血清的 RMPI上 培养液中,37C、5%CO。条件下培养。当细胞呈单层致 密状时以 2 XIO勺ml的密度接种爬片,培养箱中孵育至细 胞近100%融合时,换不含4。牛血清的肚*116叩培养 液继续培养 12小时,使细胞同步化于 G。期后分成空白 对照组、IH764-3 10mg·L*组、20 mg·L*组、30 mg·L* 组与 40 mg·L”‘组。加入相应剂量的药物,继续培养 6小 时收集细胞爬片。爬片用PBS洗3次,每次5分钟*% 甲醇4℃固定30分钟,用于免疫组织化学染色检测 TIMP.l、TGF DI。 结果:成功地建立了大鼠胆汁性肝纤维化模型。胆 2 中文摘要 总管结扎14天后大鼠肝脏呈黄色或者深黄色,表面粗 糙、质韧。肝脏明显增大,边缘变钝。小胆管广泛增生, 胶原沉积明显增加,肝小叶结构被破坏。组织学评分为 8.18土 l.17分,与假手术组的 0.00士 0.00分相比明显升 高;肝组织羟脯氨酸含量为门.586士0刀70)u g/ig肝 组织干重,高于假手术组的门.178士 0.034)u g/mg肝 组织干重(P<0.of人 IH7643治疗后肝脏增大程度减轻,表面欠光滑,肝 脏边缘稍变钝。小胆管增生程度减轻,有少量胶原沉积, 肝小叶结构基本完整。组织学评分和肝组织羟脯氨酸含 量明显低于模型组(分别为 4.92士 l.12 VS 8.18士 l.17和 (0.349士0*58)u g/mg vs(0.586士0*70)u g/mg肝 组织干重)(Pwto.of人 免疫组织化学染色示模型组TIMPl 阳性面积与假 手术组相比明显增加门.360士 l.520VS 4.310士 l.020P <0.0 人 IH764习预防组降为 7.880士 l.24o低于模型组 (Prto.of人模型组*Wl主要分布在增生的胆管周围 细胞、汇管区及纤维间隔中,假手术组仅在血管内皮细 胞、肝窦周围细胞中有弱阳性表达。模型组TGF pl 阳 性面积为10.52O士0.74O,与假手术组的4.050士0.55O 相比,差异有统计学意义(P<0刀1人IH7643预防组降 为7.100土0.800,低于模型组(P<0.of人模型组TGF pl 分布于增生的胆管周围细胞、汇管区周围细胞、汇 管区的结缔组织和窦壁细胞,假手术组仅见于门静脉及 中央静脉周围细胞。TGF pl与TIMPJ分布部位类似, 在假手术组,二者表达密切相关r--0.721(P<0刀5人BDL 3


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