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实验性大鼠急性脊髓损伤NF-κB表达及八肽胆囊收缩素抗炎作用分子机制研究

扈玉华  
【摘要】: 急性脊髓损伤(Acute spinal cord injury,ASCI)后炎症反应是脊髓继发性损伤的主要因素并在急性和慢性损伤过程中发挥重要作用。核因子-кB(nuclear factor kappa B,NF-кB)是众多细胞因子和炎症介质表达的主要转录因子,其活化可使肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-a),白介素-1(Interleukin-1beta,IL-1)等促炎因子基因过度表达。但是在脊髓继发性损伤中NF-кB及其NF-кB的抑制蛋白(Inhibitory subunit of NF-кB,IкB)表达变化规律、特别是IкB在脊髓细胞中的表达是否可作为NF-кB变化的观察指标尚不清楚。此外,胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein,GFAP)在ASCI时的变化规律与NF-кB的相互关系也有待于阐明。为此,我们采用了大鼠脊髓挫伤模型,研究ASCI后与急性炎症反应有关的病理改变,从整体水平、器官组织水平、蛋白质水平等不同层面观察NF-кB、IкB、GFAP等细胞因子表达的变化,同时对以硫酸酯化八肽活性片段存在的外源性胆囊收缩素(cholecystokinin-8,CCK-8)在急性创伤性脊髓损伤中对NF-кB、IкB、GFAP表达作用加以评价,为寻求减轻继发性脊髓损伤的新抗炎药物提供理论依据。 1、急性脊髓损伤时NF-кB在继发性损伤中变化规律的研究 本研究目的在于研究NF-кB在大鼠ASCI时细胞胞浆内及胞核内的表达变化规律。SD大鼠90只,雌雄不限,体重200~250g。在1%戊巴比妥钠腹腔麻醉下(40mg/kg),腹卧于动物立体定向架上。所有动物先行后正中入路T_(8-9)椎板切除,72只动物使用OHBA SIKI打击器(Tokyo,Japan)按Gruner改良法作成T_9脊髓背侧损伤模型,打击强度为25势能克厘米(Vgram-cm force,gcf)为损伤组,其余18只动物为对照组。所有动物分别在伤后1h、6h、12h、24h、72h、5d不同时间点处死。除对组织标本进行病理观察外,应用免疫组化、电泳迁移率变 中 文摘 要 动分析法mlectrophoretic Mobility shift Assay EMsA)及免疫印记法 (Western blot analysis)观察脊髓胞核与胞浆内 w4 B的在各个时相 点的表达。 损伤后lh镜下可见脊髓挫伤处灰质内血管破裂出血,红细胞及 血浆积聚在中央灰质、后角的血管周围,神经细胞肿胀;损伤后6h 出血波及整个灰质,神经细胞、星形细胞明显肿胀,神经细胞核周围 尼氏小体变浅;损伤后 12h,在脊髓灰质中央,依然可见片状出血, 在挫伤灶的边缘可以发现神经元细胞核固缩呈坏死样改变,并有水肿 的小胶质细胞及多形核细胞和巨噬细胞的组织浸润,组织间隙明显增 宽。损伤后24h到72h,在挫伤灶中心,脊髓结构紊乱,有大片灰质 坏死区及大量的巨噬细胞和多形核细胞浸润,在挫伤灶的灰白质交接 处有小出血点,白质水肿加重,白质内有空泡形成,以损伤后72h为 重;损伤后sd,在灰、白质坏死区可观察到泡沫样巨噬细胞、多形核 细胞;在正常组织与挫伤灶交界处,可以观察到血管内血细胞淤积, 血管壁出现白细胞浸润,白质内有空腔形成。 免疫组化结果以NFJB胞浆及细胞核表达的吸光度及阳性面积 作为相对表达量,用均数士标准差(王士S)表示、在检验进行统计学 处理。对照组仅有较弱的阳性反应①0.l士 3.l,368.30士门 .65人 损 伤后 lh表达开始增强(112.2士4.2,387.41士13 *5),P<0*1,NF-K B* 性细胞在病灶内和边缘区可以见到;损伤后 6h增强明显门 25*士 2.5, 402*2士14.57),p<0*of;损伤后12h 达高峰(175.3士2*,478.23士 14.45),p<0刀of,在神经细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、多形核细胞、 星形细胞胞浆内均有 NF4 B表达;损伤后 24h表达开始下降门 石士 2.3,440.32士14.84),p<0.001;sd逐步恢复正常p.5士2.8,379.65士 13*5),p>0*5。细胞核内的 N’F-K B在损伤后 lh(8 *上2.l,210.00士 14.40)轻度增强 p>0*5;6h后逐步增强(94*士2.3,233.46士门.45), p<0*1;12h达到高峰(146.0土3.I,298*4士15.46),p<0*of;24h后逐 渐下降(90.0士 2.4,265.13士 16.48),p<0.00;sd基本恢复正常(61.0士 2.8,205*3土 15.46),p>0*5。 应用 Western blot analysis从蛋白水平测定挫伤脊髓e4 B的胞 浆内表达。抗P65抗血清显示65KDA的明显分子条带吸光度作为相 2 中 文摘 要 对表达量,用均数土标准差G士S)表示、t检验进行统计学处理。对 照组显示一个较弱的表达条带O 刀士2.2),而损伤后 lh NF4B表达 开始增高(09.0士 2.> p<0.of;损伤后 6h增高己很明显OIZ.0士 l.7), p<0*of;损伤后 12h 达高峰门* *士 1.7),p<0*01;持续到损伤后 24h 才开始下降(124*士2二),p<0*of; sd后逐步恢复正常(103*土1.9), p>0刀5。 应用 EMSA检测 N’’F* B在细胞核内的表达情况?


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