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整合素αvβ6抑制顺铂促卵巢癌细胞凋亡的研究

李冬秀  
【摘要】: 目的:化疗在卵巢癌的治疗中发挥着非常重要的作用,这是包括手术、放疗和其他治疗都不能代替的治疗方式。化疗效果的好坏直接关系到患者的生存与生活质量,而卵巢癌的内在性耐药和获得性耐药是临床上常见的难题,如果能克服这一难题,无疑将会给卵巢癌患者提供新的治疗机会。遗憾的是迄今为止,卵巢癌的耐药机制仍不是十分清楚。多数化疗药物是通过诱导细胞凋亡而起到杀死肿瘤细胞的目的。目前有一种假说认为肿瘤细胞产生了抵抗细胞凋亡的能力就产生了耐药性。细胞凋亡是一个非常复杂的过程,受多种因素的调节和制约。肿瘤细胞的生存微环境是非常复杂的,其周围被细胞外基质(extracellular matrix, ECM)所包围,细胞通过其表面的粘附分子与ECM发生粘附。整合素即是其中的一种粘附分子,不同亚型的整合素与不同的ECM相结合,从而维持细胞的生理活动。失去了粘附能力的细胞更易于走向凋亡。近年来,整合素与ECM的相互作用对细胞凋亡的影响越来越受到人们的重视。在肿瘤细胞的生长过程中整合素可以通过抑制细胞凋亡而调节肿瘤的发生发展。整合素还可以抑制多种化疗药物诱导的凋亡,使细胞耐药。细胞粘附介导的细胞耐药(Cell Adhesion Mediated Drug Resistance, CAM-DR)已作为一固定名词被科学家提出。多数整合素在人体组织中广泛表达,但是整合素αvβ6在上皮性恶 WP=4 性肿瘤中特异表达,而在良性和正常组织中均不表达,有报道卵巢良性肿瘤组织和正常组织中整合素αvβ6不表达,而恶性肿瘤中高表达,且和分期密切相关,期别越晚表达越高,并且认为整合素αvβ6可以作为卵巢癌恶性程度的标志。卵巢癌化疗的一线药物---顺铂(DDP),也是通过诱导细胞凋亡而达到杀死肿瘤细胞的作用的。本研究拟用三株体外培养的卵巢癌细胞系做研究对象,观察整合素αvβ6对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响,并分析可能涉及的途径,以探讨细胞粘附在卵巢癌化疗耐药性产生中的作用。 方法:将卵巢癌细胞株SKOV3、3AO、AO以相同的浓度种植于6孔板中,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,于37.5°C,CO2含量5.0%,湿度99%的孵箱中24小时,用流式细胞术方法检测三株细胞中整合素αvβ6的表达。经不同浓度的DDP作用48小时后,用噻唑兰(MTT)方法检测DDP对细胞增殖的抑制情况,用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法检测细胞凋亡情况,筛选出合适的DDP浓度。用筛选出的DDP浓度刺激生长于纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)和多聚赖氨酸(POLY-L-LYSIN)上的细胞株和用整合素αvβ6特异性阻断抗体阻断后的生长于FN上的卵巢癌细胞的凋亡情况。用流式细胞术方法检测生长于FN和POLY-L-LYSIN上的细胞经DDP作用48小时后,BCL-2和3磷酸肌醇激酶(phosphatidyliynositol 3-kinase, PI-3K)的表达。 结果:一、用流式细胞术方法检测发现卵巢癌细胞 WP=5 SKOV3、AO、3AO均表达αvβ6整合素,但表达水平的高低差异无显著性(P0.05)。二、顺铂对卵巢癌细胞增殖的抑制和诱导细胞凋亡的作用:1、MTT法:卵巢癌细胞株SKOV3、AO、3AO在顺铂作用48小时之后,增值率受到抑制,且呈浓度依赖性 ,顺铂浓度越高抑制越明显(P0.01)。2、ELISA法:卵巢癌细胞株SKOV3、AO、3AO均可由顺铂诱导凋亡,即使最低浓度的顺铂(5微克/毫升)也可诱导细胞凋亡,且呈现浓度依赖性(P0.01)。3、AO/EB双荧光染色法:对照组细胞以正常细胞为主(核被AO染色,橙黄绿色-黄色荧光,密度不均,呈现结构样特征),有少量早期凋亡的细胞(核亦被AO染色,但染色增强,荧光亢进,呈均匀一致的绿色);试验组(DDP组)5微克/毫升DDP作用组仍以正常细胞为主,早期凋亡细胞比对照组多,凋亡率=10%,随DDP浓度加大,正常细胞减少,凋亡细胞增多,10微克/毫升DDP作用组即可见到晚期凋亡细胞(核被EB染色呈橙红色,可见核的断裂和浓缩),凋亡率=28%;20微克/毫升DDP作用组的正常细胞更少,晚期凋亡细胞更多,可见凋亡小体,并可见坏死细胞(核被EB染色呈橙红色,结构不清,细胞体积增大,边缘模糊)凋亡率=37%,三个浓度诱导细胞凋亡结果相比,差异有显著性(P0.01)。三、FN和特异性整合素αvβ6抗体对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响 :1、ELISA法:在10微克/毫升DDP作用48小时之后,试验组(生长于FN组)凋亡率明显低于对照组(生长于POLY-L-LYSIN组)(P0.01)。用特异性整合素αvβ6阻断抗体封闭后的细胞生长于FN后,凋亡率较未经 WP=6 特异性整合素αvβ6阻断抗体封闭的FN组繁荣昌盛高(P0.01)。2、AO/EB双荧光染色法:在10微克/毫升DDP作用48小时之后,试验组(生长于纤维粘连蛋白FN组)细胞以正常细胞为主(核被AO染色,橙黄绿色-黄色荧光,密度不均,呈现结构样特征),有少量早期凋亡的细胞(核亦被AO染色,但染色增强,荧光亢进,呈均匀一致的绿色),凋亡率=5%;对照组(生长于POLY-L-LYSIN组)正常细胞减少,凋亡细胞增多,可见到晚期凋亡细胞(核被EB染色呈橙红色,可见核的断裂和浓缩),凋亡率=28%;Ab组正常细胞减少,凋亡细胞增多,可见到晚期凋亡细胞,凋亡率=19%(P0.01)。四、FN和整合素


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