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NO在挤压大鼠双后肢致急性局部肌组织和远隔器官(肝脏、肺脏)损伤中的作用

张晓彤  
【摘要】: 目的:广泛软组织损伤为法医学实践所常见,且以臀部及双下肢损伤为主,其损伤特点是局部损伤貌似轻微,全身性继发性病理变化隐匿,后果严重,常导致远隔器官包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏等的严重损伤,直至发生创伤性多器官功能不全综合症(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。其发生机制至今尚不完全清楚。本研究室已经成功的复制出挤压复合内毒素造成动物MODS的动物模型,发现双后肢挤压伤导致远隔器官如肝脏、肾脏、肺脏等功能障碍,并伴随抗氧化能力下降,多种炎症介质和细胞因子(如TNF-α、IL-1)是促成这种器官损伤的物质基础。一氧化氮(nitric oxide,NO)系一种新颖的气体信使分子,具有多向性调节作用,同时又是一种自由基,化学性质十分活泼。一氧化氮由一组一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化L-精氨酸氧化生成,NOS主要有诱导型(iNOS)和固有型(cNOS)两类。严重创伤应激、细胞因子可诱导iNOS表达或调节 cNOS活性,改变NO的生成与功能。NO在机体病理过程中的作用十分复杂,可由于作用时间、器官、剂量等差异而具有保护和/或损伤的作用,因而有双刃剑之称。严重双后肢挤压伤致局部及远隔器官NO和NOS的变化规律及其意义尚不清楚。本实验通过挤压双后肢致远隔器官损伤模型, WP=5 尝试探讨NO在局部肌肉组织和远隔器官(肺脏、肝脏)损伤中的作用。 方法:健康Wistar大鼠55只,体重160±20g,雌雄不拘,实验前12 h禁食,自由饮水。大鼠俯卧位固定于木板上,于双后肢上压15kg的标准重物,连续挤压5 h后释放动物,任其自由活动,观察5h后大鼠在全麻下行腹部切开术,从腹主动脉采血液。经腹主动脉快速放血处死,收集检材待检。大鼠随机分成4组(1)对照组(S组),(2)挤压组(C组),(3)挤压加氨基胍组(A组),(4)挤压加L-精氨酸组(L组)。S组除不挤压外,其余处理同挤压模型。C组处理同挤压模型。A组在挤压5h松开时舌下静脉注入氨基胍(AG)10 mg/kg bw。L组在挤压5h松开时舌下静脉注入L-精氨酸 (L-Arg) 150 mg/kg bw。实验首先探讨局部NO在严重挤压大鼠双后肢致局部肌组织继发性损伤中的作用,并检测血浆中NO含量和NOS活性。从腹主动脉采集血液约2ml,离心后吸取上层血清;大鼠放血处死后,留取局部肌肉组织约200mg,制备10%肌组织匀浆。用生化方法检测血清和肌组织NO含量和NOS活性;留取局部肌肉组织适量制做病理切片、观察形态学变化及进行iNOS、eNOS免疫组化检测;另留局部肌肉组织测湿干重比值。其次探讨严重挤压双后肢致远隔器官(肺脏和肝脏)损伤和与NO变化的关系。从腹主动脉采集血液约4 ml做血气分析和肝功能检测;留取肺脏、肝脏检材各3份,分别作病理切片、观察形态学变化和iNOS、eNOS免疫组化、检测NO含量、NOS活性和组织的湿干重比值。 结果: WP=6 1 挤压双后肢致局部肌肉组织损伤及NO、NOS变化 1.1 局部肌组织损伤 肌肉湿干重比值(W/D)变化 S组W/D为3.90±0.16,C组W/D为4.74±0.22,明显高于S组(P0.01)。A组、L组W/D分别为4.5±0.25、5.3±0.38。与C组比较A组W/D降低(P0.05),L组W/D明显升高(P0.01);与 A组比较,L组W/D明显升高(P0.01)。 肌组织的病理变化 S组 肌纤维结构清楚,未见出血、坏死等改变。C 组 肌纤维肿胀,横纹不清,可见肌纤维溶解,间质水肿,可见小动脉充血和小静脉淤血及肌纤维间出血。A 组 肌纤维肿胀似有减轻,可见断裂及肌纤维溶解,间质水肿减轻,小动脉充血和小静脉淤血较C组减轻。L组 肌纤维肿胀加重,可见断裂,肌浆横纹不清,可见肌溶解,嗜伊红染色不均, 内可见空泡,肌浆凝聚与溶解相间,间质水肿较C组加重,小动脉充血和小静脉淤血及肌纤维间出血较C组加重。 1.2 局部肌肉组织NO含量、NOS活性变化 局部肌肉组织NO含量:S组NO含量为37.24±3.35μmol/g prot,C组NO含量为55.49±6.35μmol/g prot,明显高于S组(P0.01)。A组、L组NO含量分别为39.49±6.18μmol/g prot、71.34±6.29μmol/g prot。与C组相比较A组NO含量降低(P0.01),L组NO含量升高(P0.01)。 局部肌肉组织NOS活性: S组NOS值为10.97± 0.53U/mg prot,C组NOS值为16.41±0.85U/mg prot,明显高于S组(P0.01)A组、L组NOS值为分别为13.39 WP=7 ±0.64U/mg prot、15.12±0.73U/mg prot。与C组相比较,A组NOS值降低(P0.01)、L组NOS值无明显变化(P0.05)。 1.3 局部肌肉W/T与肌肉NO含量变化的相关分析 各组肌组织NO值与W/T值均呈明显正相关。S组相关系数为0.926(P0.05);C组相关系数为0.992(P0.01);A组相关系数为0.925(P0.05);L组相关系数为0.892(P0.01)。 1.4 局部肌肉组织eNOS和iNOS蛋白表达免疫组化检测 局部肌肉组织eNOS蛋白表达免疫组化检测:S组肌肉组织可见血管内皮细胞和骨骼肌纤维有黄棕色的eNOS信号其中内皮细胞eNOS信号较强;C组血管内皮细胞和骨骼肌纤维中黄棕色的eNOS信号明显增强,以内皮细胞增强为明显;A组、L组血管内皮细胞和骨骼肌纤维中黄棕色的eNOS阳性信号与C组比较无明显差异。 局部肌肉组织iNOS蛋白表达免疫组化检测:S组骨骼肌纤维


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