CCK-8对大鼠成纤维细胞样滑膜细胞增殖及MMPs产生的影响及其可能作用机制的研究

【摘要】： 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、炎症性自身免疫病。以持续性滑膜炎症，滑膜组织增生、新生血管形成和进行性滑与软骨组织结构破坏为病理特征。病变常经久不愈，最终可导致患者的残障和生存期缩短。 RA的病因至今未明，但多数研究认为，免疫平衡失调，尤其是Th1/Th2型免疫应答失衡和促炎性细胞因子（如TNFα、IL-β、IL-12、IL-15、IL-18、IL-6等）的产生过多，在RA的发病中可能具有重要作用。近年的研究则表明，除上述因素外，RA患者的成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS)，在RA的发病、慢性炎症的维持和骨与软骨的结构破坏方面可能具有重要的作用。滑膜炎症，滑膜组织增生和血管翳形成，关节软骨和骨组织结构的破坏，是RA的主要病理组织学改变。活化的滑膜组织可以表达和分泌多种粘附分子，细胞趋化因子、促炎性细胞因子和生长因子，如血管细胞间粘附分子-1(vascular cell adhesion molacular-1 ,VCAM-1)、细胞间粘附分子-1（intracellular adhesion molecule-1 , ICAM-1）、巨噬细胞趋化蛋白(macrophage chemotactic pntein-1, MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)、IL-1、IL-6、IL-8、粒细胞和巨噬细胞克隆剌激因子(granulocyte-macrophage clony stimulating factor, GM-CSF) 等。它们可募集巨噬细胞，中性粒细胞和淋巴细胞到病变关节部位，并使之活化、增生和分化，促进炎症反应的发生；它们产生的血管内皮生长因子(vescular endothelial growth factor ,VEGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生的生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等能够促进新生血管及血管翳的形成；它们所产生的细胞外基质降解酶，包括多种金属蛋白酶 WP=5 （metalloproteinases , MMPs）和组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶K和蛋白聚糖酶（agreencanase），则可以降解关节的细胞外基质成分和软骨内的聚糖成分（agreencan），是引起关节结构破坏的主要原因。而滑膜组织的活化增生，是所有这些病变的基础。关于滑膜组织增生的原理，仍存在有较多争议。一般认为，成纤维细胞样滑膜细胞生长特性的改变及凋亡缺陷是滑膜组织增生的一个主要原因。Muller-ladner和Fassbender 等的研究发现RA FLS具有转化细胞的表型特征和生长特性，如细胞呈多形性，胞浆丰富，核仁显著，锚定非依赖性生长的和接触抑制的丧失等；Imamura等则发现RA FLS有单克隆或寡克隆细胞扩张的存在；端粒酶的活化在细胞增殖和永生化方面具有重要作用，RA FLS中也有端粒酶活性检出。这些结果都提示在滑膜组织增生中，RA FLS的主动增殖起着主导作用。鉴于RA FLS细胞在脱离炎症微环境后依然能保持此生长特性，这种改变有可能是永久性的基因型改变。这种改变的发生机制，则可能与p53抑癌基因的体细胞突变和原癌基因c-myc、 c-jun、c-fos等的活化有关。RA FLS具有p53抑癌基因的负显性突变，这种突变可导致p21的合成减少和周期素-1的合成增加使细胞进入增殖周期，从而引起滑膜增生。在另一方面，炎症关节局部促炎性细胞因子的存在，从而剌激细胞活化和增殖是滑膜增生的另一个重要原因。其中TNFα是滑膜细胞增生和活化的有效剌激剂，可显著剌激RA患者滑漠细胞的增生，细胞因子的分泌和细胞外基质降解酶的产生。TNFα通过与其受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)结合而发挥生物学作用。有研究表明，RA患者滑膜成纤维细胞上有TNFRs的表达，TNFα可以通过下调TNFR1的和上调TNFR2表达促进RA患者滑膜细胞的增生。而由于促炎性细胞因子的剌激、癌基因的活化及信号传导系统的改变，则又可以引起RA-FLS的凋亡缺陷，使之不能发生或不能完成凋亡过程。延长了RA FLS的生存期，则可从另一方面导致滑膜组织增生的发生。 CCK-8属于脑肠肽，具有明显的抗炎作用。在动物实验中，它表现有明显的抗内毒素休克作用，可显著抑制内毒素休克大鼠血浆、肺脏和脾脏的TNFα 、IL-1β和IL-6的产生。在离体实验中，CCK-8可明显抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞(pulmonary intenstitial WP=6 macrophages, PIM)TNFα的产生和核转录因子NF-κB的活化。近年来通过对的血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和垂体腺苷酸环化酶激活多肽(petuitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)的研究发现，VIP/PACAP具有与CCK-8类似的免疫凋节和抗炎作用。动物实验研究发现VIP和PACAP都能显著降低小鼠胶原性关节炎的发病率,完全消除了关节肿胀和骨与软骨的结构破坏，并发现这种治疗作用是与疾病的炎性和自身免疫成分的下调是相关的 。离体实验研究也发现VIP对于RA患者的FLS增生具有明显抑制作用。认为VIP和PACAP可能具有用于RA治疗的潜在价值。Manni等的研究发现CCK-8的拮抗剂丙谷胺，具有加重关节炎症的作用。但CCK-8对于RA患者FLS的活化和增生是否也有相似的作用尚未见报道，据此我们观察了CCK-8对于大鼠滑膜传代细胞株RSC-364和CIA大鼠FLS增殖、凋亡及基质金属蛋白酶2、9