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RGD依赖的整合素信号通路对肝纤维化大鼠、肝星状细胞胶原代谢的调控作用及丹参单体干预研究

刘丽  
【摘要】: 肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种慢性肝脏疾病导致的细胞外间质(extracellular matrix,ECM)成分过多合成及异常沉积,是各种慢性肝损伤共同的病理变化,有很高的发病率和死亡率。肝纤维化的主要病因包括病毒性肝炎、酒精中毒以及胆道梗阻等。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肝纤维化的形成过程中发挥关键作用。正常情况下,HSCs主要储存维生素A,并发生少量增殖,合成少量胶原。然而,肝损伤后,HSCs内维生素A消失并转化成肌成纤维样细胞,即活化的HSCs,表达α―平滑肌肌动蛋白(α―smooth muscle actin,α―SMA)并且合成各种ECM成分。 活化的HSCs不仅是ECM的主要来源,还表达参与ECM降解的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及其抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)。诸多细胞因子和生长因子可以影响HSCs活化,调节MMPs及TIMPs的分泌。然而,最近发现细胞-ECM间的相互作用与这些因子一样,可以调节HSCs分泌MMPs和TIMPs。整合素(integrin)是广泛存在于细胞表面的跨膜糖蛋白,是ECM成分的主要受体,是细胞内外信息交流的桥梁,因此,整合素可能介导了ECM对MMPs和TIMPs分泌的调节。 ECM与整合素结合首先引起粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)分子聚集在粘着斑(focal adhesion plaque,FAP)处,使FAK N-端区的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后可能激活多条信号途径,其中比较清楚的是RAS依赖的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)是MAPK家族中研究得最为清楚的成员,其通路RAS-RAF-MEK-ERK参与细胞多种功能活动。本研究从HSCs与ECM之间的相互作用着手,以FAK、ERK1/2为切入点,有机结合整体和离体试验,研究整合素信号通路在 WP=5 肝纤维化及HSCs中对MMP及TIMP的影响。实验内容主要包括以下四部分: 第一部分:MMP-13、TIMP-1在大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达 目的:探讨实验性大鼠肝纤维化形成过程中与ECM代谢有关的MMP-13、TIMP-1的动态表达以及TIMP-1与ECM主要成分I型胶原之间的相互关系。 方法:采用胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)大鼠肝纤维化模型,将80只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术组与模型组。模型组分别于结扎后2h、6h、2d、1wk、2wk、3wk、4wk麻醉动物,假手术组与4wk模型组同批麻醉。采用HE染色确定模型建立情况,Masson三色染色测定ECM沉积情况;免疫组织化学方法研究Ⅰ型胶原在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化;RT-PCR方法研究MMP-13 mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化;原位杂交和Western blot技术分别观察TIMP-1 mRNA及蛋白表达情况。 结果:①Masson三色染色显示随着肝纤维化的发展,造模1~4wk大鼠肝组织内胶原纤维所占的面积(10.41%±1.33%,17.32%±1.53%,33.67%±2.28%,42.63%±1.68%)均显著高于假手术组(7.35%±1.14%),P<0.05。②随着肝纤维化发展I型胶原在肝脏内大量沉积,从汇管区向外延伸,并广泛存在于纤维间隔及增生的小胆管周围,中央静脉周围强阳性染色,增生的粗大的胶原纤维包绕肝细胞形成明显的假小叶,Disse间隙内有I型胶原沉积。造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝组织内的I型胶原阳性面积分别为8.57±1.88%,13.51±2.93%,30.88%±3.30%,38.05±3.72%,除第1wk外,其余各组均显著性高于对照组假手术组(5.35±1.88%),P<0.01。即肝纤维化程度越重,I型胶原染色阳性面积所占比例越大。③MMP-13 mRNA在肝纤维化形成过程中无明显变化。④随着结扎时间的延长,TIMP-1 mRNA的表达呈持续上升趋势.造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝脏组织内TIMP-1 mRNA阳性面积分别为17.59%±1.70%,25.89%±1.93%,31.82%±1.24%,37.29%±2.65%,均显著高于假手术组(4.77%±0.97%),P<0.01,与Ⅰ型胶原呈显著正相关。⑤正常肝组 WP=6 织TIMP-1蛋白微量表达,造模6h开始上调,造模4wk TIMP-1表达最高,比假手术组增加1倍以上。 结论:肝纤维化形成过程中ECM沉积是其主要病理改变,其中Ⅰ型胶原增加最明显;肝纤维化形成过程中主要是TIMP-1表达的变化,无论是蛋白水平还是mRNA水平,都显著增加,MMP-13 mRNA无显著变化。 第二部分:精-甘-天冬-丝氨酸四肽对肝星状细胞胶原代谢的影响及机制研究 目的:探讨精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)四肽对纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)刺激的HSCs合成胶原、表达MMP-13以及TIMP-1的影响,为利用RGDS四肽调控HSCs胶原代谢提供实验理论依据。 方法:应用体外HSCs培养技术,采用3H-脯氨酸(3H-pro)掺入法测定HSCs胶原合成;采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率;RT-PCR方法检测MMP-13 mRNA水平;应用原位杂交和Western blot技术分别检测TIMP-1 mRNA和蛋白水平。阴性对照组采用精-甘-谷-丝氨酸(RGES)四肽。 结果:①RGDS四肽25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1组对HSCs 3H-pro掺入结果与对照组、FN组相比,均显著下降,P<0.01,掺入抑制率分别是23.15%、


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