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ET—1对肝硬化门脉高压的作用及CNP、丹参对ET—1介导肝星状细胞收缩的调控机制

姚冬梅  
【摘要】: 门脉高压(portal hypertension,PHT)系肝硬化腹水形成、上消化道出血、肝肾综合征等严重并发症的病理基础,其发生主要系门脉血流阻力增加和门脉血流量增加综合作用的结果。门脉压力增加的病理生理学基础是由肝脏纤维组织增生、疤痕组织以及肝脏再生结节压迫导致肝脏本身结构改变,同时肝细胞肿胀和肝窦毛细血管化在一定程度上也介导了门脉血流阻力的增加。随PHT进展进一步导致门脉血流量增加,它又维持和加重了PHT。门脉血流量的增加系内脏以及全身血管高动力循环所致,表现为心输出量增加,平均动脉压(mean artrial pressure ,MAP)下降,全身血管阻力下降以及血容量增加。尽管肝纤维化所致肝脏结构的改变在肝内血管阻力调节中起重要作用,但近年来认为除此之外,多种血管活性物质在增加肝内血管阻力上亦发挥重要作用。许多学者在肝硬化患者和动物模型均观察到血浆内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、一氧化氮(nitric oxide ,NO)水平的增加,并同肝硬化严重程度密切相关,因此,肝硬化时ET-1、NO等血管活性物质增加、功能失调所致门脉血流阻力增加和周围动脉扩张在PHT的形成和维持中可能发挥重要作用。由于目前尚乏同时对ET-1、NO在肝脏及外周血管调节作用的研究,本课题采用离体肝灌注和离体血管环技术研究了ET-1、NO对离体肝脏门静脉压及离体血管环收缩的影响,探讨了ET-1、NO在PHT发生、发展中的作用。 近年来肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肝纤维化中的重要作用已得到认识并达成共识。多项体内外研究表明HSCs在肝脏微循环调节以及PHT的形成中起重要作用,在ET-1、凝血酶、血管紧张素Ⅱ(angiotensin, AngⅡ)、精氨酸加压素、NO、利钠肽A(atrial natriuretic peptide,ANP)等多种血管活性物质作用下,被激活的HSCs对其产生收缩或舒张反应,其中ET-1引起的收缩反应最强,而NO等物质可促进HSCs舒张,Ca2+在介导HSCs舒缩中可能发挥重要作用。 WP=5 由于HSCs在肝纤维化以及PHT中的重要作用,目前HSCs已成为降低门脉压治疗的靶细胞。研究表明,ET-1在PHT的发生发展中起重要作用,而HSCs是ET-1重要的靶细胞,因此,进一步从细胞水平研究ET-1介导HSCs收缩的细胞内信号转导机制,将为靶向应用HSCs收缩抑制剂提供理论基础。鉴于目前尚乏关于ET-1、NO介导HSCs收缩调控机制的探讨,本研究借助激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM),采用第三代钙荧光探针Fluo-3/AM观察ET-1介导 HSCs胞浆游离钙([Ca2+]i)荧光强度的变化,探讨ET-1引起HSCs [Ca2+]i升高的机制,为寻求抑制ET-1介导的HSCs收缩的有效药物提供依据。 C型利钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)属利钠肽家族,可对血管平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、软骨细胞等多种细胞发挥舒张和抗增殖效应,但尚乏CNP对慢性肝病作用的研究,Vollmar等研究表明肝脏有利钠肽受体mRNA的表达,Gulberg等观察到肝硬化患者血浆CNP浓度下降,将CNP静脉注入肝硬化大鼠体内出现门脉压力下降和心输出量增加,因此,CNP对慢性肝病治疗具有一定作用,但其是否对HSCs有直接舒张和抗增殖效应目前鲜有研究,本课题拟从多角度研究CNP对HSCs介导细胞增殖的第二信使(环化腺苷酸[cyclic adenosine monophosphate,cAMP]、环化鸟苷酸[cyclic guanosine monophosphate,cGMP])及细胞增殖分化的共同传导通路丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及DNA合成的影响,并借助LSCM对CNP与ET-1介导的HSCs [Ca2+]i变化进行研究,从而为CNP用于肝纤维化及PHT治疗提供理论依据。 丹参(radix salviae miltiorrhizae,RSM)是目前临床应用较为广泛的主要活血化瘀药物,以丹参为主药的系列中药组方抑肝纤、复方861合剂、扶正化瘀方、强肝胶囊以及“益肝浓缩煎剂”等已证实具有肯定的抗肝纤维化作用。但其在PHT治疗中的研究尚少,李校天等通过临床和动物实验研究表明,丹参可改善肝硬化患者临床症状,降低门静脉内径,门静脉血流量,同时降低肝硬化犬门静脉压,而对平均动脉压、心率无影响。表明丹参既可有效降低肝硬化犬的门静脉压力,又无全身血液动力学副作用,为一有希望的降门脉压药物。但其机制 WP=6 尚未完全阐明,丹参降门脉压作用是否与抑制HSCs收缩有关,目前尚乏研究。因此,本课题通过制备丹参浸膏借助LSCM和细胞免疫组化的方法观察丹参对HSCs [Ca2+]i和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表达的影响,进一步从细胞水平探讨丹参降门脉压作用的机制。 第一部分:ET-1、NO对肝硬化大鼠不同病期离体肝脏及血管环调节作用研究 目的:探讨ET-1、NO对不同病期肝硬化大鼠离体肝脏及血管环调节作用及其变化规律。 方法:皮下注射四氯化碳制备大鼠肝硬化模型,根据造模不同时间肝组织病理改变,有无腹水对肝硬化进行分期,在造模9周末(肝硬化早期E-HC)和14周末(肝硬化晚期L-HC)采用离体肝灌注及离体血管环技术研究不同浓度ET-1对不同病期肝硬化大鼠肝血流动力学


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