血管新生和血管内皮细胞生长因子在急性髓系白血病中的意义及三氧化二砷的抗血管新生作用

【摘要】： 目的：近30年肿瘤领域研究的重大进展之一是确立了血管新生在肿瘤发展中的重要地位与抗血管新生治疗的意义。血管新生（angiogenesis）和血管生成（vasculogenesis）是两个截然不同的过程。血管生成是指在胚胎发生和器官形成过程中，从中胚层内皮细胞中分化出新的内皮细胞以形成原始血管网的过程，仅见于胚胎发生的早期，出生后即停止。血管新生是指在已经存在的血管的基础上以出芽的方式形成新的微血管的过程，可见于胚胎发生期以及出生后。生理条件下发生的血管新生是一严格受控的过程，在创伤修复、伤口愈合和女性的生殖周期等生理过程中起重要作用。而病理性的血管新生则是一个无序、无控制的过程，这种持续的无规则的血管新生推动了疾病的发展。肿瘤的生长可分为无血管期（avascular stage）和血管期（vascular stage），在无血管期肿瘤主要依赖周围组织的弥散作用来获取营养物质和排泄代谢产物，肿瘤的生长受到明显的限制，肿瘤的直径一般不超过1～2mm；而在血管期肿瘤内出现新生的毛细血管并获得了进一步生长的能力，从而肿瘤迅速生长并发生转移。肿瘤的血管新生能力决定了肿瘤的生长、浸润和转移能力。血管新生在实体肿瘤中的作用研究比较充分，但在恶性血液病中的研究较少，作用尚不明确，国内尚无有关方面的研究。近年来国外学者发现在急性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合症等疾病中存在血管新生，但有关的结论并不一致。肿瘤细胞可分泌刺激内皮细胞迁移和毛细血管增殖的因子来促进血管新生。促进血管新生的因子中以血管内皮细胞生长因子（VEGF）最重要。其生物学功能包括促进内皮细胞的增殖、提高血管通透性及改变细胞外基质使其更易于血管的生长等，同时VEGF对造血祖细胞克隆的形成有促进作用。VEGF通过其受体发挥作用。VEGF有三种高亲和性的受体。近年来抗血管新生治疗成为肿瘤治疗的一大热点。抗血管新生治疗可通过干扰促血管新生因子的 WP=5 活性或增强血管新生抑制剂的效应来实现，如抑制VEGF的产生、阻断VEGF受体或阻断信号的传导途径、抑制基质蛋白酶、抑制内皮细胞的迁移和活化等。定位于血管新生的治疗代表了一种特异的、毒性小而有效的治疗方式。最近有研究认为三氧化二砷（As2O3）也有抑制血管新生作用。为了研究血管新生及血管内皮细胞生长因子在急性髓系白血病发病中的作用及三氧化二砷的抗血管新生作用，我们研究了急性髓系白血病（AML）患者骨髓组织的微血管表达情况，并从蛋白质和基因转录水平研究了VEGF的表达和分布情况及其与AML预后的关系。同时观察As2O3对白血病细胞株K562、NB4细胞及脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、凋亡、bcl-2蛋白表达和VEGF分泌水平的影响，以探讨血管新生和VEGF在急性髓系白血病发病中的作用以及三氧化二砷的抗血管新生作用。目前国内尚无有关方面的研究，国内外均未见三氧化二砷对HUVEC bcl-2蛋白表达影响的研究报道。本研究的目的在于探讨VEGF在急性白血病中是否呈现过度表达，探讨将其作为白血病转归及预后指标的可行性，试图为临床的治疗提供简便可靠的观察指标。同时探讨As2O3是否具有抗血管新生作用，能否应用于APL以外的白血病。建立准确的测定方法是正确评价VEGF作用与临床价值的基础。我们同时选用了免疫组织化学、酶联免疫吸附和PT-PCR等三种方法检测骨髓组织或白血病幼稚细胞中VEGF的表达，三者相互补充。 方法：1. 临床资料：初治急性髓系白血病（AML） 28例，男性12例，女性16例，年龄11～74岁（平均38.5±14.4岁）。其中M1 3例，M2 2例，M3 9例，M4 4例 ，M5 8例，M6 2例。除M3 外均采用标准DA方案(M3 采用维甲酸+化疗)。分别于治疗前和诱导化疗后第21天骨髓抑制恢复后于髂后上棘行骨髓穿刺和活检术咬取骨髓组织。对照组20例，均为骨髓形态学及病理学检查正常的白细胞减少症和未累及骨髓的实体肿瘤的骨髓活检组织。白血病组和对照组的年龄、性别无显著性差异。 2. AML患者治疗前后骨髓组织Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ-R-Ag ）、VEGF及其受体KDR、Flt-1的表达：采用免疫组化染色技术测定AML患者诱导化疗前后骨髓组织中Ⅷ-R-Ag 、VEGF、KDR、Flt-1的 WP=6 表达，研究VEGF表达与 AML预后及骨髓组织血管新生的关系。免疫组化的步骤严格按照操作说明书进行。简而言之，石蜡包埋的骨髓组织制成5μl切片，用 H2O2室温5-10分钟以灭活内源性酶；微波加热修复抗原；滴加正常山羊血清封闭液封闭非特异性抗原，然后加入稀释的一抗（Ⅷ-R-Ag、VEGF、KDR或Flt-1），4℃过夜，用 PBS洗涤。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG。滴加SABC试剂， PBS洗4次；DAB显色，苏木素复染，显微镜下观察。用Ⅷ-R-Ag来显示骨髓组织中微血管。每张切片先在100倍视野下选择3个血管最多的区域为“热点区”，然后在400倍视野下计数每个“热点区”的微血管数，用3个热点的微血管数的平均数来表示微血管密度（MVD）。VEGF、KDR、Flt-1阳性结果的判定：凡胞浆出现棕黄色染色为阳性，表达情况采用半定量计分方法。即对每张切片阳性细胞的着色强度及阳性细胞比例（0%，25%，50%，75%）分别计分为0，1，2，3。然后根据两项计分之和进行判断，“0-2”为阴性，“3-6”为阳