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血管生成、细胞增殖在从肝炎到肝癌中的表现特征及意义

李胜棉  
【摘要】: 目的:(1)分析组织学参数、生物学指标(CD34指数及Ki-67指数)在评价慢性C型肝炎发展至肝硬化、肝癌中的意义;探讨组织学参数﹑血管生成及细胞增殖的相互关系;比较各参数评价慢性C型肝炎预后预见优势,寻找慢性C型肝炎更可靠的预后评价因子。(2)分析患者因素、病毒因素、生化学指标以及组织学参数、生物指数(CD34指数,Ki-67指数)与干扰素治疗慢性C型肝炎疗效的关系。(3)阐明CD34、CD31、vWF、α-SMA、Ki-67、Bcl-2在肝细胞肝癌中的表达及临床病理学特征,进一步比较HBV相关及HCV相关的肝细胞肝癌中CD34的不同表达。(4)比较正常肝组织、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞肝癌组织及肝转移腺癌中CD34、CD31、Ki-67不同表达,寻找有助于鉴别不同性质病变的生物学标记物。(5)通过以上诸方面研究,阐明血管生成、细胞增殖在从慢性肝炎进展至肝细胞肝癌发病机制中的作用。(6)探讨超声成像,尤其是三维彩色血管能量成像(3D-CPA)对肝癌血供的诊断价值,比较超声成像与临床病理资料结果。 方法:(1)研究对象 1993年3月~1999年12月于日本諏訪赤十字病院行超声引导下肝活检慢性C型肝炎患者73例;男37 例,女36例,年龄52.4±11.3(18~71)岁;从活检之日起随访所有患者至少3年,随访期间,进展至临床失代偿期肝硬化9例,原发性肝癌(HCC)4例;所有病例分为显著进展组(肝硬化、肝癌组)和非显著进展组。上述患者中行单纯α-干扰素治疗病例60例,男31例,女29例,年龄52.3±11.7(18~72)岁,其中仅1例患者超过70岁;所有患者均为干扰素治疗初治患者,6个月内无其它治疗。肝癌患者分为两组;第一组为2000年9月~2001年11月于河北医科大学第四医院行肝切除肝癌患者,共29例,男24例,女5例,年龄51.6±9.3(31~68)岁;第二组为1993年6月~2002年2月于日本諏訪赤十字病院行肝切除肝癌患者,共7例,男6例,女1例,年龄 WP=5 60.1±7.6(52~73)岁;所有患者术前均未行任何治疗。正常肝组织(取自肝血管瘤、肝转移瘤切除肝边缘)10例,男8例,女2例,年龄59.6±13.4(41~86)岁,肝硬化组织(取自肝癌切除肝边缘)7例,男6例,女1例,年龄60.1±7.6(52~73)岁;结肠癌肝转移5例,男4例,女1例,年龄59.0±8.3(48~68)岁;乳腺癌肝转移2例,男0例,女2例,年龄49.5±2.12(48~51)岁。超声检查肝癌248例,其中58例行3D-CPA检查。30例进行3D-CPA与临床病理对比研究。所有病例诊断均符合相应诊断标准。 (2)组织学分析 慢性C型肝炎标本苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)、Azan-Marroy和过碘酸Schiff反应(periodic acid Schiff reaction, PAS)染色。光学显微镜下观察,每张切片至少包括5个汇管区。从汇管区炎症、片状坏死及桥接坏死、小叶内变性及坏死、汇管区扩大及桥状纤维化诸方面对每张切片进行评价,并根据Knodell[8]等提出的肝组织活动指数评分系统(histology activity index, HAI)进行定量评分。 (3)免疫组织化学染色技术 ABC(avidin-biotin complex)法。 所有标本10% 福尔马林固定,石蜡包埋。脱石蜡切片抗原修复, 抗原修复使用微波加热或胰蛋白酶处理。CD31、vWF、α-SMA、Ki-67、Bcl-2抗原修复采用微波加热,切片放在PH6.0 10mmol/l缓冲液中,微波炉加热15分,冷却15 分,蒸馏水冲洗;CD34抗原修复采用胰蛋白酶处理,切片置入37℃ 0.2%胰蛋白酶磷酸盐缓冲液中(phosphater-buffered saline,PBS),然后容器放置于64℃溶融机45分钟。使用0.3%过氧化氢甲醇溶液预处理,以消除内在过氧化氢酶活性。特异一次抗体室温孵育1 小时,抗原检出使用LSAB-2(DAKO)套系及其二氨基联苯胺(DAB)和过氧化酶。最后,切片苏木精染色。 特异一次抗体分别为抗CD34(DAKO,M7165,monoclone)1∶25稀释,抗CD31(DAKO,M0823,monoclone)1∶30稀释,抗Ki-67(Immunotech,505,monoclone)1∶50稀释,抗vWF(美国ZYMED公司,polyclone),抗α-SMA(美国ZYMED公司,monoclone), 抗Bcl-2抗体(DAKO,Clone124) 1:40 稀释。 WP=6 省略一次抗体作为阴性染色对照。已知阳性染色组织分别作为阳性染色对照。正常肝组织10例作为对照组。 免疫组化染色结果评价:对于CD34,阳性染色参照EL-Assal[ 9 ]描述的方法计算CD34指数。在未知病人临床资料情况下,计数肝实质内阳性染色细胞,每个棕染的可与周围细胞或其它组织区分开的血管内皮或内皮细胞簇,均作为一个可计数的阳性染色细胞。200倍光镜下从染色阳性高密度区开始,计数3个连续视野,取其均值作为CD34指数。CD31指数、vWF指标、α-SMA指标计数参照CD34 指数。对于Ki-67,400倍高倍镜下从染色阳性高密度区开始计数至少1000个肝细胞,其中阳性染色细胞数作为Ki-67指数。对于Bcl-2,胞浆染色肝细胞为阳性染色。 (4)干扰素治疗方案及疗效评价 α-干扰素,每日600万单位~900万单位,肌内注射,连用2周,其后每周3次,连用22周。总疗程24周。干扰素总量:480~720百万单位。疗效评价分为完全治愈(complete response, CR)、部分有效(partial response, PR)、无效(non response, NR)。CR满足以下两条件:治疗6个月内血


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