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hrg-1基因表达与功能研究

姜广建  
【摘要】:高血压是环境因素和遗传因素相互作用所引起的多基因疾病。血管活性肽及其受体、生长因子和细胞因子及其受体、细胞信号转导蛋白、细胞周期调控蛋白等都与高血压的发生有关,这些能影响血压的基因称为高血压相关基因。 高血压相关基因(hypertension-related gene, hrg-1)是用差异显示技术对SHR和WKY大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)cDNA文库进行筛选时分离得到的一个与VSMC增殖相关的新基因,因其在SHR VSMC中表达活性降低而得名。后来发现,该基因不仅在VSMC中表达,在心、肾、脑、肺、肝、白细胞等不同组织中也有广泛分布。虽有研究揭示,转染hrg-1蛋白能抑制Raf(Raf-1)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性,下调抗细胞凋亡基因(bcl-2)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达及抑制细胞增殖。但目前关于hrg-1基因表达产物影响VSMC增殖、迁移、分化的机制尚不清楚,其亚细胞定位及在胚胎发育中的作用也未见报道。本研究课题从细胞、蛋白和分子水平上探讨hrg-1在VSMC 再分化及信号转导过程、卵分裂和早期胚胎发育中的作用及其对VSMC增殖、迁移、细胞周期相关蛋白和细胞周期进程的影响。 1 hrg-1在VSMC再分化过程中的表达及功能研究 为研究hrg-1表达与VSMC再分化的关系及其在细胞生物学行为调节方面的作用,本部分实验采用血清饥饿培养和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)诱导方法使处于增殖状态的去分化型VSMC再分化,观察细胞再分化过程中hrg-1基因表达活性与VSMC表型标志基因(SM22α、SM α-actin)表达、细胞形态特征及生物学行为之间的关系。实验结果如下: 1.1 atRA诱导去分化型(合成型)VSMC 24 h后,分化型(收缩型)VSMC标志基因SM22α表达活性明显增加,48 h达高峰,达对照细胞的2.5倍,至72 h仍维持在较高水平上;另一个分化型VSMC标志基因SM α-actin表达活性在atRA诱导24 h后达对照的2倍,且随着时间的延长,表达活 WP=5 性持续增加。形态学观察结果显示,传代培养的去分化型VSMCs 呈上皮样形状,被atRA诱导分化的细胞呈长梭形。在血清饥饿培养的VSMCs,其表型标志基因表达和细胞形态学变化与atRA诱导分化的细胞相一致。结果提示,血清饥饿和atRA诱导均可使VSMCs从合成型向收缩型转化,即发生再分化。 1.2 VSMCs经血清饥饿培养24 h 或常规培养的VSMCs 被atRA处理24 h后,hrg-1基因表达活性显著升高,其mRNA水平分别是对照细胞的2.38和2.05倍,至72 h, 其表达仍维持在较高水平上。用 Western印迹检出的HRG-1含量变化与用RT-PCR检出的mRNA含量变化相一致。免疫细胞化学染色结果显示,血清饥饿培养24 h的细胞,其胞质内HRG-1阳性染色颗粒与对照组相比明显增多。表明VSMC再分化过程中HRG-1表达活性增加。 1.3 以HRG-1抗体和蛋白A-Sepharose对VSMCs裂解液进行免疫沉淀后,用SM α-actin(细胞骨架微丝的主要成分)抗体进行蛋白印迹的实验结果表明,在VSMCs经血清饥饿诱导分化后,HRG-1抗体沉淀HRG-1的同时也使SM α-actin发生沉淀,即免疫沉淀物中出现明显的SM α-actin的条带,随着血清饥饿时间的延长,条带趋于加深。用HRG-1和SM α-actin抗体对VSMCs进行免疫双荧光染色后,激光共聚焦显微镜下观察发现,在血清饥饿培养24 h 的VSMCs中,HRG-1和SM α-actin在细胞同一区域共定位。表明血清饥饿不仅可诱导HRG-1和SM α-actin表达,而且,HRG-1在胞质中以与SM α-actin相互缔合的方式存在。 1.4 用携带hrg-1全长cDNA的pcD2-hrg-1真核表达质粒转染VSMCs,经400 μg/ml G418筛选后, 刮去玻片一侧的细胞,将玻片置于含10% NCS的M199培养基中,继续孵育24 h后检测细胞迁移活性,结果显示hrg-1过表达使VSMCs迁移能力受到显著抑制。 上述结果提示,血清饥饿和维甲酸诱导均可使VSMCs从合成型向收缩型转化,即发生再分化。VSMCs再分化过程中HRG-1表达活性增加,HRG-1主要在胞质中以与SM α-actin相互缔合的方式存在,并且在调节VSMC迁移活性方面发挥一定作用。 2 hrg-1基因对VSMC周期蛋白E(cyclin E)和P27蛋白表达及细胞增殖的影响 WP=6 hrg-1作为高血压相关基因被克隆,既往研究发现心钠素(ANF)、降钙素基因相关肽(CGRP)和肾上腺髓质素(AM)等抑制VSMC增殖的血管活性肽均可上调hrg-1基因表达,由此提示,HRG-1可能是VSMC增殖的负调控因子,但其抑制细胞增殖的作用机制目前尚不清楚。细胞周期调节蛋白是细胞周期进程的调控因子,对细胞增殖的调节发挥重要的作用。HRG-1抑制VSMC增殖是否与调节细胞周期调节蛋白表达活性有关目前尚不明了。本部分实验采用pcD2-hrg-1真核表达质粒转染体外培养的VSMCs,观察该基因过表达对cyclin E和P27表达及细胞增殖的影响,探讨HRG-1抑制VSMC增殖与细胞周期蛋白表达和细胞周期进程之间的关系。结果如下: 2.1 转染pcD2-hrg-1真核表达质粒后,与转染绿色荧光蛋白(pEGFP-C2)的对照细胞相比,细胞生长速率明显减慢,在转染24、48、72 h后,细胞增殖速率分别被抑制14.8%、37.8%、35.4%;相反,在转染hrg-1反义RNA表达载体的细胞,其生长速率明显加快,转染48 、72 h后,增殖速率分别增加33.6%、28.7%。 2.2


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