海狗油的精制及对脂肪肝和前列腺增生的防治作用及其作用机理

【摘要】：目的: 海狗油最早见于《本草纲目拾遗·卷九·兽部》但基本无临床应用实例,本文探讨海狗油的纯化方法,使之达到高浓度药用标准，并建立相应检测方法及确认其结构; 探讨海狗油对实验性脂肪肝和前列腺增生的防治作用及其作用机理, 为临床应用提供指导, 对稀有药源的综合利用提供依据。 方法: 1 采用高效液相色谱法(HPLC)测定海狗油的有效成份即三种ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3Polyunsaturated Fatty Acids，ω-3PUFA）──二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的含量(ω-3是指其结构中，长链不饱和脂肪酸的碳末端第3位碳原子上有第1个不饱和键) ，具体为柱前衍生反相HPLC法，海狗油的衍生方法为碱催化一步转酯化，考察衍生化温度、时间、衍生化试剂甲醇钠稳定性等影响因素，确保衍生完全，确定最佳衍生方法。选择HPLC的检测波长、测试浓度、取样量、色谱柱、流动相、流速、柱温等最佳色谱条件, 作系统适用性试验并验证方法学包括线性范围、精密度、检测限及定量限、专属性、耐用性、准确度和重复性。 2 纯化方法为分子蒸馏法，考察蒸馏温度、进料速率、刮膜器转子速率、进料温度等对分离纯化的影响，确立最佳蒸馏工艺条件。 3 应用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振等四大谱确认三种ω-3PUFA的结构。 4 观察海狗油对长期喂食高脂饲料引起的大鼠脂肪肝的预防和治疗作用，大鼠脂肪肝模型的复制为于实验第一天一次性皮下注射40%四氯化碳的橄榄油溶液3ml·kg-1，并开始长期饲以高脂饲料。预防作用实验为造模的同时给予相应药物即除10只大鼠未经任何处理作 WP=6 为空白组外，5组(n＝10) 造模大鼠:病理模型组灌胃（ig）给予等体积橄榄油，阳性药组ig辛伐他汀4 mg ·kg-1，海狗油低、中、高剂量组分别ig海狗油0.5 g·kg-1、1.6 g·kg-1、4.8g·kg-1，每天1次，连续10周。治疗作用实验为大鼠造模7周后病理检查脂肪肝模型成立，按体重随机分为5组(n＝10) ，病理模型组灌胃（ig）给予等体积橄榄油，阳性药组ig辛伐他汀4 mg ·kg-1，海狗油低、中、高剂量组分别ig海狗油0.5 g·kg-1、1.6 g·kg-1、4.8g·kg-1，每天1次，连续8周，另有10只大鼠未经任何处理作为空白组； 预防和治疗实验期间，观察大鼠活动、进食、粪便、皮毛等一般情况,于最后一次给药禁食过夜后断头处死大鼠, 生化测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、葡萄糖（GLU）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、丙二醛（MDA）、游离脂肪酸（FFA）及超氧化物歧化酶（SOD）; 比色测定肝脂TC、TG及肝中MDA、FFA、SOD含量，放射免疫法测定肝的血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α) 含量. 称量肝重计算肝脏系数(肝重g/100g体重) ；组织学检查:肝脏肉眼观察后，迅速制作冰冻切片苏丹Ⅲ染色(特异性脂肪染色)，及制作石腊包埋切片，HE染色和细胞色素P450 2E1(CYP2E1)免疫组织化学染色(采用链霉素抗生物素蛋白～过氧化酶免疫组织化学法（SP法），DAB显色，一抗CYP2E1的工作浓度为1：800，操作流程按试剂盒说明书进行，每次试验均设阴性对照，以PBS替代一抗) ，于光学显微镜下观察结果。 5 对肝细胞的保护作用实验为研究海狗油对乙硫氨酸致小鼠和大鼠急性肝损伤及四氯化碳致大鼠急性肝损伤的影响, 乙硫氨酸致小鼠和大鼠急性肝损伤实验:雄性KM种小鼠和Wistar大鼠各70只，按体重随机各分为7组，每组10只,分别为对照组、模型组、阳性药组、海狗油低、中、高剂量组和鱼油组；空白组和模型组灌胃(ig)等体积橄榄油，阳性药组ig联苯双酯(小鼠0.2g/kg, 大鼠0.16g/kg)，海狗油低、中、高剂量组分别ig海狗油(小鼠0.8g/kg、2.4g/kg、7.2g/kg，大鼠0.5g/kg、1.6g/kg、4.8g/kg), 鱼油组ig鱼油1.0 g/kg, 每天给药1次，连续9天，给药第7天，除对照组外，均ig DL-乙硫氨酸(小鼠0.25g/kg,大鼠0.2g/kg) ，于第 WP=7 9天下午灌胃给药4小时（DL-乙硫氨酸造模后48小时）后，断头放血处死小鼠或大鼠，剖腹取肝，制备20%肝匀浆，2500rpm离心5分钟，取上清液测肝脂TG含量。海狗油对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的影响， 取大鼠70只，随机分为7组，分别ig橄榄油(空白组)，橄榄油(模型组)，联苯双酯0.16g/kg(阳性药组)，海狗油0.5g/kg(海狗油低剂量组)、1.6g/kg(海狗油中剂量组)、4.8g/kg组(海狗油高剂量组)和鱼油1.0 g/kg(鱼油组)，每组10只, 每天给药1次，连续7天。第6天给药后5小时，除空白组外，均腹腔注射(ip)四氯化碳10mg /kg体重，于第7天上午给药1小时后（在四氯化碳造模后20小时）断头取血, 分离血清,按试剂盒的要求，比色法测定ALT、AST含量并对肝脏作组织学检查，常规制作石腊包埋切片HE染色。统计学检验各组ALT、AST含量差异的显著性. 6 海狗油对前列腺增生的抑制作用研究, 大鼠前列腺增生模型的复制 ，取性成熟雄性大鼠60只，除10只作为空白对照组外，其余50只ip乌拉坦0.5g.kg-1麻醉下，无菌操作摘除双侧睾丸，观察饲养1周后，按体重随机分为模型组、阳性药组、海狗油低（0.5g.kg-1）、中（1.6g.kg-1）、高（4.8g. kg-1）剂量组，每组10只，每只皮下注射(