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拆方益肝康及药物血清对肝星状细胞活化增殖、胶原代谢及细胞因子影响的研究

房红梅  
【摘要】:肝纤维化(liver fibrosis)是肝脏受到慢性损伤时,针对损伤因子所产生的一个自我愈合过程,同时又是所有慢性肝病进展成肝硬化的共同病理基础与必经阶段,是影响慢性肝病预后的重要环节。目前认为肝纤维化可以逆转,而肝硬化则不能逆转。我国是肝病高发国家,以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最为常见,严重影响着我国人民的生命质量和劳动力水平,在当前尚无良好抗病毒方法的情况下,阻止或逆转肝纤维化进程已成为慢性肝病相当重要的治疗对策。 肝纤维化的病理学基础为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成增加,降解减少,导致胶原过度沉积。而肝脏内主要胶原合成细胞—肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活、增殖则是肝纤维化发生的中心环节。慢性肝损伤后,HSC在某些激动因子作用下,形态与功能表型发生较大改变,其中又以细胞活化增殖、表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及ECM生成增多为最显著的活化特征。 HSC的活化是由静止HSC向肌成纤维细胞(myofibroblaster,MFB)转化的过程,依赖于众多细胞因子的网络调节中,其中血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)起着最为关键的作用。PDGF是最强的促HSC分裂增殖因子,TGF-β1是最强的促胶原生成因子。PDGF、TGF-β1等细胞因子可激活HSC,促进HSC活化、增殖及合成ECM,而活化的HSC又可激活更多的细胞因子,形成放大环。因此,抑制PDGF、TGF-β1等细胞因子表达成为抗肝纤维化治疗的新靶点、新热点。 随着肝纤维化发生机制的逐渐阐明,使肝纤维化的预防,治疗,甚至逆转成为可能。但迄今为止,现代医学尚无良好治疗方法,而中医中药对肝纤维化的良好预防和治疗效果及低毒性反应等特点目前已引起国 WP=5 内外学者的广泛关注。近年来,大量实验与临床研究证实运用活血化瘀为主的方法治疗肝纤维化均取得了较好疗效。中药复方“益肝康”是消化系专家姚希贤教授根据中医基础理论和几十年临床经验精心研制而成的治疗慢性肝病良药,其前身为“益肝冲剂”,于80年代投产并应用于临床,因其良好疗效而乏不良反应深受广大患者欢迎,“益肝康”为研制者对“益肝冲剂”进一步研究改进而成。 中医中药抗肝纤维化研究业已取得可喜成果,但中药作用机制及有效物质的研究一直是中药新药开发与中药研究的热点和难点。中药复方尤其是较粗的制剂含有较多的杂质,如直接加入体外反应体系,其酸碱度、渗透压、鞣质和无机盐等非特异性理化因素将严重干扰实验,导致实验的假阳性或假阴性结果。1984年血清药理学方法在日本提出后,对准确再现中药复方在体内发挥作用的“有效成份”提供了一种有力的工具。目前许多文献报道含药血清均来自于正常动物血清,但药理作用是药物与机体相互作用的结果,不同生理病理状态机体对药物的代谢途径不同,从而血清中的药物浓度、代谢产物和诱生的有效成分的质与量也会不同,因此利用正常动物药物血清进行体外实验尚难在最大程度上反映药物在病态机体内生物转化的真实过程。 为此,本研究拟采用“对比血清药理学方法”,即:一方面给正常大鼠灌服药物,另一方面采用CCl4造模后肝纤维化大鼠进行药物灌服,再分别提取两种不同药物血清进行体外HSC培养,并同时设立生药纯化浸膏直接作用于细胞进行对照,观察益肝康及拆方——丹参小复方(丹参、黄芪、归尾)对肝纤维化形成过程中三个重要靶点——HSC增殖、α-SMA表达及ECM合成的作用情况,以及对PDGF-BB与受体PDGFR-β (platelet-derived growth factor receptor-beta,PDGFR-β)、TGF-β1与受体TβR-I(transforming growth factor beta receptor-I,TβR-I)基因及蛋白表达的影响,以进一步从细胞及分子水平深入研究“益肝康”抗肝纤维化的作用及机制,探讨其药效学配伍意义,寻找新的药物作用靶点,从“益肝康”复方中筛选更为有效的中药成分,进一步重组、精简组方,为抗肝纤维化中药新药开发提供实验基础。 第一部分: 拆方益肝康对肝星状细胞活化增殖及胶原代谢影响的研究 目的:探讨益肝康及其拆方——丹参小复方(丹参、黄芪、归尾) WP=6 纯化浸膏对HSC增殖、α-SMA表达及ECM合成的影响。 方法:采用体外HSC株培养技术。水蒸醇提法制备益肝康及丹参小复方纯化浸膏(13.52g生药/mL)。实验分组:A:对照组;B:丹参小复方组(B1:416mg/mL、B2:208mg/mL、B3:104mg/mL、B4 :52mg/mL、B5 :26mg/mL);C:益肝康组(C1:416mg/mL、C2:208mg/mL、C3:104mg/mL、C4:52mg/mL、C5:26mg/mL)。孵育HSC 24h后,采用3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)掺入法检测HSC增殖;流式细胞技术检测细胞周期;透射电镜观察HSC超微结构;免疫细胞化学法检测α-SMA表达;3H-脯氨酸(3H-proline)掺入法检测HSC胶原合成。实验数据以均数±标准差( ±s)表示,采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析和LSD分析,以P0.05为显著性差异。 结果:①益肝康及丹参小复方浸膏对HSC的3H-TdR掺入均有显著抑制作用(P0.01),益肝康在26mg/mL~416mg/mL浓度范围内掺入抑制率分别?


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