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吗啡对大鼠脑组织内神经甾体的调节机制研究

闫彩珍  
【摘要】:吗啡类中枢镇痛药是临床应用镇痛效果最好的药物之一,但由于长 期应用可引起机体产生依赖和耐受,因而其临床应用受到限制,并且阿 片类物质的滥用或成瘾已造成日益严重的社会问题。然而,其成瘾机制 目前尚不清楚,因此,对其机制的探讨已成为神经科学工作者研究的重 要课题之一。 神经甾体是指在中枢神经系统合成的甾体和经血脑屏障进入神经系 统发挥作用的外周甾体及其代谢衍生物的总称。最近有研究表明,神经甾 体可以抑制小鼠吗啡依赖和耐受的形成,减弱戒断症状的产生,并影响 大鼠条件性位置偏爱的形成,发挥其偏爱或嫌恶作用。以上研究提示神 经甾体可能影响有关的药物奖赏过程。因此设想,吗啡依赖是否影响了 内源性神经甾体的生物合成?内源性神经甾体是否在阿片依赖的形成过 程中发挥作用?了解阿片类物质对内源性神经甾体的影响,对阐明吗啡 的成瘾机制及设计对抗吗啡依赖和耐受形成的药物具有重要意义。 尽管人们通过免疫组化、原位杂交、RT-PCR 等方法已证实神经甾 体合成酶在大鼠各脑区有不同程度的存在,且对于神经甾体在中枢神经 系统合成与代谢的途径也已基本阐明,但是对于病理情况下神经甾体合 成酶的活性表达变化却了解很少。已有研究表明,急性乙醇注射可以调 节大鼠各脑区神经甾体合成与代谢的关键酶 StAR,P450scc,3β- HSD,3α-HSD mRNAs 的表达。但慢性吗啡处理是否影响神经甾体合成 与代谢酶的表达未见报道,如果慢性吗啡依赖和戒断影响了大鼠脑部神 经甾体的含量,那么这种变化是否与神经甾体合成与代谢酶在中枢神经系 统中的表达水平调控有关尚不得而知。已知甾体合成酶的表达具有脑区 特异性,那么这种区域特异性与吗啡成瘾的神经回路是否有关联?这些 问题的回答对阐明阿片调节神经甾体合成与释放的机制有重要意义,同 时可以通过神经甾体合成酶的兴奋剂或抑制剂调节神经甾体生成,进而 达到其治疗目的。 本实验采用气相色谱-质谱联用技术,建立了一种简单、灵敏和特异 1 WP=5 中 文 摘 要 性强的检测方法,可以同时测定大鼠脑组织中游离型和结合型神经甾体 的含量;建立大鼠吗啡依赖、戒断和复吸模型,观察大鼠吗啡依赖、戒 断和复吸时神经甾体在脑组织中含量的变化;并应用 RT-PCR 方法,观 察吗啡依赖和戒断时神经甾体合成与代谢的三种关键酶 P450scc, P450c17,3β-HSD mRNAs 在大鼠脑部额叶皮质、海马、杏仁核、纹状 体和中脑的表达活性,为研究内源性神经甾体与慢性吗啡成瘾的关系提 供依据,旨在探讨吗啡成瘾的神经生物学机制。 主要实验结果与结论如下: 1.气相色谱-质谱联用测定大鼠脑部神经甾体 本实验建立了气相色谱-质谱联用技术测定大鼠脑组织内神经甾体的 方法。游离型神经甾体孕烯醇酮(PREG)、黄体酮(PROG)、别孕烯 醇酮(AP)、脱氢表雄酮(DHEA)及结合型神经甾体孕烯醇酮硫酸酯 (PREGS)、脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)分两步萃取。第一步用乙酸乙 酯提取游离型甾体,第二步用氯仿/2-丁醇提取甾体硫酸酯, 然后经过固 相萃取方法进行纯化。甾体硫酸酯部分进行溶剂解形成游离型甾体,经 溶剂解的甾体硫酸酯部分和游离型甾体部分分别与七氟丁酸酐(HFBA)进 行衍生化,然后进行气相色谱-质谱分析。气相色谱以无分流方式运转, 柱温升温程序从 50℃升至 150℃(30℃/min),再升至 280℃(10℃ /min)。载气 (氦气)流速为 1ml/min。气化室和界面的温度分别为 230 ℃和 280℃。质谱在电喷雾离子化模式下进行。根据甾体全扫描质谱 图,确定神经甾体衍生物 DHEA-HFB、PREG-HFB、PROG-HFB 和 AP- HFB 的主要特征离子分别为 m/z 270、m/z 298、m/z 510 和 m/z 514。 DHEA 和 DHEAS 的检测限为 1pg/μl, PREG 和 PREGS 的检测限为 2pg/μl,PROG 和 AP 的检测限分别为 2pg/μl 和 5pg/μl。雄性大鼠脑部游 离型神经甾体 PREG、PROG、AP、DHEA 的含量分别为 8.53±1.11ng/g, 7.01±2.6ng/g, 1.17±0.19ng/g, 0.92±0.2ng/g,甾体硫酸酯 PREGS 和 DHEAS 的含量分别为 5.94±2.03ng/g 和 1.93±0.92ng/g。本方法采用组 合式液/液萃取分离游离型甾体和甾体硫酸酯,经固相萃取纯化,无需额 外的 HPLC 纯化步骤,方法较为简便。线性范围、准确度、精密度实验 显示本方法适用于同时测定大鼠脑组织中游离型和结合型甾体。 2 WP=6 中 文 摘 要 2. 吗啡依赖和戒断时大鼠脑组织内神经甾体含量的变化 本实验采用剂量递增法腹腔注射造成大鼠吗啡依赖模型,给药第 1-7 天的剂量分别为 5mg.kg-1,10mg.kg-1,15mg.kg-1,20mg.kg-1,30mg.kg- 1,40mg.kg-1和 50mg.kg-1,每天注射两次,共 7 天,对照组给予相同剂量 的盐水,腹腔注射纳洛酮 2mg.kg-1 催促戒断反应。吗啡依赖大鼠脑组织 内神经甾体 PREG、PROG 和 PREGS 的含量分别较对照组下降 62%、 92%和 60%(P0.01)。然而,吗啡对脑组织内 DHEA 和 DHEAS 的含 量无显著影响。纳洛酮可诱发吗啡依赖大鼠产生明显的戒断症状,吗啡 戒断大鼠脑组织内神经甾体 PREG, PR


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