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食管癌细胞MT-3基因CpG岛超甲基化的意义以及食管癌组织DNA提取方法的优化

田子强  
【摘要】:目的:我国是食管癌的高发国家,特别是河北南与河南北部,食管癌病死率为全球最高的地区之一,因此,深入研究食管癌的发病机制,以有效地对其进行预防和治疗,在该地区殊为重要。与其它恶性肿瘤一样,食管癌的发生是多种癌基因的激活与抑癌基因的失活长期协同作用的结果。基因异常甲基化是目前所知的除突变、缺失和移位之外的另一种基因异常改变,与其它基因异常相比,基因的甲基化研究不仅对恶性肿瘤的病因、早期诊断及预后评价有很大价值,而且对肿瘤的基因治疗研究有着重要的作用。目前已知,食管癌的发生与p16(INK4a)等多种基因的异常甲基化有关。MT-3基因是细胞内一种金属硫蛋白的编码基因,不仅具有许多重要的生理功能,还可以抑制细胞增殖,已有研究发现MT-3基因在胃癌中存在异常甲基化,但该基因在食管癌中的甲基化情况尚无人研究。本课题应用COBRA分析和RT-PCR方法检测食管癌细胞株、新鲜食管癌标本及食管癌标本的石蜡包埋组织中的MT-3基因的甲基化情况及其对MT-3表达的影响,以揭示MT-3基因甲基化在食管癌发生、发展中的作用。同时对我院的普通甲醛固定石蜡包埋组织中的DNA降解情况,以及这些标本中提取DNA的方法进行了研究。 方法 1. 选取四种食管癌细胞株OE21,OE19,OE33和TE7,在DNA甲基转移酶抑制剂5-氮2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)处理前后分别提取其DNA和RNA,应用重亚硫酸钠处理+限制性酶切图谱(COBRA)分析以限制性内切酶BstU I消化,对所提DNA的MT-3基因CpG岛的甲基化情况进行对比研究,应用RT-PCR技术对所提RNA的MT-3 mRNA的表达情况进行对比研究。 2. 取68例食管癌患者的新鲜手术标本及上、下切缘正常组织,分别提取其DNA和RNA。应用COBRA技术以限制性内切酶BstU I消化,研究所提DNA中MT-3基因的甲基化情况;应用实时RT-PCR技术,研 WP=6 究所提RNA的MT-3 mRNA的表达情况,然后与各临床病理参数进行比较。 3. 取2000年河北医科大学第四医院胸外科普通甲醛固定的食管癌标本蜡块10例,1984年普通甲醛固定的标本蜡块10例,2000年澳大利亚皇家阿德雷德医院病理科中性缓冲甲醛固定的食管癌标本蜡块10例,新鲜食管癌组织3例,以蛋白酶K消化NaCl盐析法分别提取其DNA,进行电泳和PCR扩增分析,研究其DNA的降解情况。 4. 取我院2000年手术切除的甲醛固定石蜡包埋的食管癌标本10例,分别以蛋白酶K消化酚氯仿抽提法,蛋白酶K消化氯化钠盐析法和不同pH值下加热提取法提取DNA,然后进行电泳和PCR扩增分析,以比较不同方法提取DNA的质量。 5. 取我院2000年至2001年手术切除的甲醛固定石蜡包埋的食管癌标本15例,在蛋白酶K消化法进行DNA提取的过程中,应用交叉设计对脱蜡方法,消化温度,消化时间和抽提方法四种参数进行研究,所得DNA质量用电泳分析和PCR扩增结果判断,以寻找蛋白酶K消化法自石蜡包埋组织中提取DNA的理想实验条件。 6. 选取我院2000年5月至2001年8月切除的食管鳞癌标本的石蜡包埋组织47例,应用上述研究所筛选出的蛋白酶K消化氯化钠盐析法提取肿瘤、上切缘、下切缘及转移淋巴结的标本蜡块DNA,经重亚硫酸化处理后,应用COBRA分析技术,以限制性内切酶BstU I消化研究其甲基化情况,所得结果与新鲜食管癌手术标本结果、各临床病理参数及随访资料进行比较研究,以明确MT-3基因甲基化在食管癌发生发展中的作用,和普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA进行甲基化研究的可行性。 结果 1. 四种细胞株MT-3基因的CpG岛均存在不同程度的超甲基化,以OE33甲基化水平最高,OE19甲基化水平最低。 2. 经5-aza-CdR处理后,四种细胞株中MT-3基因的超甲基化状态基本解除,其中细胞株OE33和OE21已检测不出有甲基化存在。 3. RT-PCR结果显示,四种细胞株在5-aza-CdR处理前,MT-3基因mRNA的表达均较弱,其中,细胞株OE33检测不到MT-3基因表达;经5-aza-CdR处理后,四种细胞株中MT-3基因RNA的表达均显著增强。 WP=7 4. 统计学分析显示,各细胞株经5-aza-CdR处理后mRNA含量较处理前明显增多(t=11.027,P=0.002)。 5. 68例新鲜食管癌手术标本中,共11例(16.2%)肿瘤组织发现MT-3基因甲基化,而所有患者的上、下切缘的正常组织均未检测到甲基化。 6. 实时RT-PCR显示:原发肿瘤存在甲基化的11例患者的肿瘤组织中MT-3 mRNA的表达水平为2.54±1.11 copies/μg RNA,不存在甲基化的57例患者的肿瘤组织中表达水平为5.13±1.86 copies/μg RNA,二者比较有统计学意义(t=5.103,P=0.027)。 7. 根据手术后病理资料,食管癌中MT-3基因的甲基化与患者转移淋巴结的数目有关。原发肿瘤存在甲基化的11例患者中,平均每例有7.2枚转移淋巴结。而不存在甲基化的57例患者的平均转移淋巴结数为4.3枚。两者比较有统计学意义(Z=3.149, P=0.001,Wilcoxon检验)。 8. 肿瘤组织的甲基化情况与肿瘤的病理分期有关,分期越晚,甲基化的比率越高(χ2=6.952,P=0.031),但甲基化情况与患者的性别、肿瘤部位、组织分化程度及肿瘤侵犯深度均无关(P均>0.05,χ2检验)。 9. 不同来源的石蜡包埋组织所提DNA经PCR扩增结果显示,所有标本均能扩增出100 bp的ALAD,各标本之间的差异不大,对于198 bp 的ALAD,198


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