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大蒜素对宫颈癌Hela细胞HPV18-E6 p53 hTERT基因表达影响的研究

杜辉  
【摘要】:目的: 宫颈癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤,死亡率为妇科恶性肿瘤之首,从宫颈癌前病变发展成为宫颈癌是一个较为漫长的过程,大约需要十年甚至更长,因此,宫颈癌是一个可预防、可治愈的疾病。及时发现早期宫颈癌,及时恰当的处理,治愈率几乎达100%。因此,在宫颈病变的早期及时阻断其向恶性方向发展,防止宫颈癌发生,具有重要意义。现已证实人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)是宫颈癌的重要致病因素,但由于HPV病毒尚未能在体外成功培养,故关于宫颈癌的预防性研究相对滞后。本实验在前人研究的基础上,筛选一种诱导宫颈癌细胞凋亡的药物——大蒜素,观察其是否能对整合入Hela细胞中的HPV18病毒基因序列中的癌基因E6、 P53和端粒酶的表达产生影响,以此为基础来推测该种药物能否对HPV病毒基因序列中的E6基因产生影响,从一个新的角度对HPV病毒的生物学性状进行研究。为宫颈癌的临床预防、治疗提供实验室理论依据。 方法 1细胞培养:常规方法复苏冻存于液氮罐中的人宫颈癌Hela细胞,接种于含10%胎牛血清RPMI~1640培养液的培养瓶中,置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养,每天观察细胞生长情况,待细胞生长至70%融合时(约2~3 WP=4 天),EDTA消化,制成单细胞悬液,以备实验用。 2 MTT比色法测定细胞生长抑制情况:调整细胞密度至3×104个细胞/ ml,充分混匀,接种到96孔培养板中,每孔200μl,置于培养箱内培养,至对数生长期,吸去上清液,实验组分别加入200μl新鲜配制的不同浓度的大蒜素培养液,浓度分别为25mg/L、 50 mg/L、 100 mg/L,对照组加入200μl培养液。每天于显微镜下观察细胞生长情况,分别于24小时、48小时、72小时取出培养板,每孔加入20μl(浓度为5g/L)MTT,轻振培养板,置培养箱中孵育4小时后,弃去上清液,加入二甲基亚砜200μl,室温震荡8分钟,使其彻底溶解,于酶标仪570nm波长处测其吸光度A值,计算出抑制率(IR)。同法重复实验3次。抑制率(IR)=(1–实验组A值/对照组A值)×100%。 3光学显微镜观察细胞形态:调整细胞密度至3×104个细胞/ ml,接种到预置盖玻片的24孔培养板中,每孔1ml。置于培养箱内培养,至对数生长期,更换培养液,加入药物。实验组加入终浓度分别为25mg/L、 50 mg/L、 100 mg/L、200 mg/L的大蒜素,同样设对照组,12小时、18小时、24小时、48小时、72小时后取出盖玻片,Gimsa染色,光镜下观察细胞形态。 4透射电镜观察细胞形态:将细胞按照上述浓度接种于培养瓶中,上述浓度药物作用12小时、18小时、24小时、48小时、72小时后,收集细胞,2.5%戊二醛前固定,清洗后1%锇酸后固定,常规脱水,浸透,环氧树脂包埋,切成超薄切片,透射电子显微镜观察细胞形态。 5 TUNEL法检测细胞凋亡:按照光学显微镜观察细胞 WP=5 形态方法获得细胞爬片,置于培养箱内培养,至对数生长期,更换培养液,加入药物。药物浓度同上,设对照组。24小时、48小时、72小时后,按照TUNEL试剂盒说明操作,对细胞爬片进行处理,细胞核染成棕褐色者为凋亡细胞,核蓝色者为阴性。每个视野计数100个细胞,每张片计数3个视野,阳性细胞数占细胞总数的百分率即为凋亡指数(AI)。 6用PCR和RT–PCR方法研究HPV18 E6基因、P53基因、hTERT基因表达在细胞凋亡过程中的变化:用Trizol提取细胞总RNA。取扩增产物,经1.5%琼脂糖凝胶电泳(含EB),90V,45分钟,在紫外灯下观察结果,并在读胶仪AlphaImager1200上进行扫描,观察条带的灰度强弱,结果以目的基因与β–actin的积分吸光度的比值表示。 结果 1光学显微镜下细胞形态学改变:Hela细胞形状不规则,可为多角形、梭形等,核仁2~3个。大蒜素作用48小时,经Gimsa染色,光镜下可见细胞体缩小,胞膜完整,核染色质致密固缩,聚集于细胞核一侧,呈新月形;聚集于核的两端,呈八字形;聚集于整个核膜,呈周边化;或者可见到细胞核碎裂为花瓣状、大小不等的核片断。 2三种浓度大蒜素作用于细胞24小时、48小时、72小时细胞生长受到不同程度的抑制,明显高于对照组;各浓度间及各时间抑制率差异显著(P 0.05)。呈剂量、时间依赖性。72小时抑制率分别为38.46%、56.25%、65.32%、76.33%。 3透射电子显微镜下细胞形态学改变:实验组细胞呈现细胞凋亡样改变: 表现为细胞体积变小,细胞微绒毛消失, WP=6 胞内大量空泡形成;常染色质增加,核质比例减小;部分细胞呈典型的凋亡改变:核膜内陷,不规则,细胞染色质边集,固缩,紧靠核膜,聚居于细胞核核膜下,呈境界分明的团块状、花瓣状,细胞核碎裂、固缩,胞质呈片状脱落。随着药物浓度的增加及时间的延长愈加明显。对照组凋亡现象不明显,染色质分布均匀,可见1~2个核仁。 4 TUNEL标记结果:大蒜素作用不同时间后,凋亡细胞胞核经TUNEL染色呈棕褐色,核固缩、染色质凝集成块儿或边集。三种浓度大蒜素作用24、48、72小时细胞凋亡率均明显高于对照组(P 0.01),各浓度间凋亡率比较差异亦有显著意义(P 0.01)。 5大蒜素对Hela细胞株中HPV18E6、hTERT表达的影响:用RT-PCR检测Hela细胞株中HPV18E6基因表达,对照组和实验组Hela细胞均在352bp处扩增出


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