新生乳鼠早期肠道细菌移位与细菌定植及其相关因素的综合性研究

【摘要】：目的：新生儿期细菌移位是发生在新生儿早期的一种一过性肠道原籍菌的移位。有动物实验证明健康、正常的新生动物可以普遍发生肠道的细菌移位。本实验的目的是：1采用细菌培养，鉴定，革兰氏染色及厌氧菌代谢终产物的气相色谱分析等方法，动态观察新生乳鼠出生后0-30天其肠道细菌定植过程及其肠道细菌移位现象，深入、系统地分析肠道细菌移位现象与肠道中菌群结构关系，从微生态角度出发解释新生儿早期细菌移位现象发生的机制及在临床上的意义。2利用流式细胞仪测定新生大鼠脾脏中CD3和CD25淋巴细胞的数量，分析细菌移 位与免疫功能的相互关联及相互影响，探讨细菌移位现象与其免疫系统功能的关系。3采用新生乳鼠腹腔注射抗生素的方法，对比观察新生乳鼠在应用抗生素后其肠道菌群结构的变化和细菌移位率的改变，以了解抗生素对新生儿肠道细菌移位的影响。本研究结论为临床上新生儿早期活菌制剂的早期干预，及早建立肠道微生态平衡，提高机体抗病能力，降低新生儿感染性疾病的发生率，及临床上合理用药，合理治疗，避免因医源因素造成新生儿自身肠源性感染提供重要的理论依据。 　　方法：⑴试验动物：SD乳鼠120只，均为母乳喂养，断奶后自由正常进食。⑵动物分组：所有动物随机分为两组：实验组20只，动物于出生后每日腹腔注射青霉素钾， WP=4 并于生后第7天处死。对照组100只，分别于生后即刻、生后第3天、第7天、第14天、第30天各处死动物20只。⑶取材：所有动物均为断颈处死，处死后在无菌条件下，分别取末端回肠袢、肠系膜淋巴结、肝、脾及血液进行细菌培养。⑷细菌培养：取出的各组织经研磨，稀释后，选取适当的稀释度接种于不同的培养基，普通血平板用于培养需氧及兼性厌氧G+球菌，中国兰平板用于培养需氧及兼性厌氧G-杆菌， BS培养基培养双歧杆菌， LS培养基培养乳酸杆菌。置血平板和中国兰平板于37℃孵箱，需氧培养24-48小时后看结果，置BS培养基和LS培养基于厌氧罐中，采用Caspak厌氧培养法,48-72小时后看结果。采用形态学、常规生化反应、API系统、色谱分析等技术对培养出来的细菌进行鉴定及记数。⑸CD3、CD25计数：所有动物处死后，取新鲜脾脏，制成单个核细胞悬液，用流式细胞仪分别计数。 结果： 新生乳鼠肠道正常菌群的定植过程及影响因素的分析 肠道正常菌群的定植过程 刚出生时，乳鼠肠道是无菌的。出生后不久，肠道菌群开始定植。G+球菌最先定植，于出生后第3天60%动物的肠道内出现G+球菌，G-杆菌的定植略迟于G+球菌，在生后第3天约30%的动物出现G-杆菌的肠道定植， G-杆菌定植后，其数量增加迅速，很快超过G+杆菌。乳酸杆菌和双歧杆菌在生后第3天只在40%的动物中定植，但定植后其数量迅速增长，于生后第7天时所有动物肠道出现乳酸杆菌和双歧杆菌且数量超过需氧菌，成为肠道的优势菌。 WP=5 1.2 抗生素对肠道细菌定植的影响 新生乳鼠腹腔注射抗生素后，实验组乳鼠肠道四种细菌的数量与对照组比较发生明显改变，表现为需氧菌数量增高，厌氧菌数量下降，厌氧菌与需氧菌的比例下降，表明发生菌群失调。 新生乳鼠早期肠道细菌移位现象极其相关因素研究 2.1新生乳鼠早期肠道细菌移位过程 肠道中无细菌定植时，其外周组织的细菌培养为阴性；肠道中细菌定植后，动物即发生不同程度的细菌移位。在生后第3天，开始出现肠系膜淋巴结的细菌移位，于生后第14天，肠系膜淋巴结的细菌移位达高峰；此后，细菌移位率下降，但仍有30%的动物在生后30天以后肠系膜淋巴结的细菌移位仍存在。肝的细菌移位发生在生后第3天，移位的细菌数量在第7天最多。与至肠系膜淋巴结的细菌移位不同的是，至肝脏的细菌移位下降明显，于生后30天所有动物的肝组织细菌培养阴性。脾的细菌移位无明显规律性，14天组30%动物有脾的细菌移位，30天组10%动物有脾的细菌移位。所有实验动物自出生至生后30天的血培养均为阴性。 2.2 免疫状态与新生乳鼠肠道细菌移位的关系 CD25/CD3在生后呈逐渐上升趋势，在生后14天时达高峰.MLN的细菌移位率在生后也呈现曲线上升趋势，且高峰时间也出现在出生后14天，CD25/CD3和MLN的细菌移位率的相关分析具有正相关（r=0.625，P0.05） 2.3 抗生素对新生乳鼠肠道细菌移位率的影响 WP=6 与正常乳鼠比较，应用抗生素腹腔注射组的动物其细菌移位率有明显上升，各个脏器如肠系膜淋巴结，肝，脾的细菌移位率也较正常乳鼠有明显上升。 　　结论 1. 新生儿肠道菌群的定植是个复杂的过程，是由新生儿期的发育特点决定的，并可以受到多种因素影响。其中抗生素是重要的影响因素之一，它通过杀灭厌氧菌，造成需氧菌数量上升，改变肠道菌群中细菌比例变化，影响肠道正常菌群结构，改变了正常菌群的肠道定植过程。 2. 在国内首次提出了健康动物在新生早期存在细菌移位现象，并认为这种现象是不可避免的，呈现“一过性”，切肠道厌氧菌的数量和免疫功能的完善在细菌移位中发挥重要作用。 3. 细菌移位现象具有双重作用，即在早期可作为抗原，刺激机体免疫功能的建立，又可作为机体的潜在危险因素，在某种条件下成为内源性感染的致病因素之一。 4.大量应用抗生素在新生儿早期会影响正常菌