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柔肝消癥颗粒对肝硬化大鼠免疫调控相关细胞因子的影响

王少贤  
【摘要】:目的:柔肝消癥颗粒(由生黄芪、炒白术、郁金、香附、青皮、白芍、三棱、莪术、丹参、地鳖虫等药物组成)具有化瘀消癥、疏肝理气、益气健脾的功效,为导师杨牧祥教授经多年临床观察筛选的效方,对肝硬化具有显著的治疗效果,为探讨其作用机制,采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,然后给予药物治疗,通过观察其对天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)的影响,探讨了本方保护肝功能方面的作用机制;通过观察其对肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)以及肝细胞转化生长因子(TGF-β1)的影响,探讨了本方抑制免疫损伤的作用机制;并运用HE和Masson染色法观察本方对肝组织病理形态学的影响。 方法:选取Wistar大鼠60只,正常喂养1周后,随机分为造模组48只和正常对照组12只。造模组首次予皮下注射40% CCl4 花生油溶液0.5ml /100g, 以后每周2次皮下注射0.3ml/100g, 共9周。造模开始前2 周均以20% 猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料喂养,第 3~9 周以0.5%胆固醇和 99.5% 玉米面混合饲料喂养。造模期间以 30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常对照组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9周末确认造模成功后予以分组治疗。除正常 WP=5 组外,将造摸组大鼠随机分为4组,每组10 只,雌雄各半,即:(1)正常对照组(简称“正常组”):灌服生理盐水1ml/100g体重,每日1次;(2)模型组:灌服生理盐水1ml/100g体重,每日1次;(3)柔肝消癥颗粒高剂量组(简称“高剂量组”):用药剂量为0.32g/100g体重,每日1次灌胃;(4)柔肝消癥颗粒低剂量组(简称“低剂量组”):用药剂量为0.16g/100g体重,每日1次灌胃;(5)阳性药对照组(简称“对照组”): 用复方鳖甲软肝片溶液,0.13g/100g体重,每日1次灌胃。5组均于造模结束后第2天起连续灌服生理盐水或治疗药物4周,于最后一次给药禁食12h后,用10%水合氯醛(0.2ml/kg)将大鼠麻醉,腹部正中切口,腹主动脉取血,将血样低温离心,分离血清,采用比色法测定血清ALT、AST、TP、Alb含量;采用放免法测定血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。同时迅速剖取动物肝脏、脾脏,用滤纸吸去表面液体,称取湿重,计算肝脏指数、脾脏指数。在肝脏最大叶距边缘0.5cm处取1cm×1cm×1cm大小肝组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,运用免疫组织化学方法观察TGF-β1的表达变化,并用HE染色和Masson染色,光镜下观察肝组织病理形态学变化。 结果 1 柔肝消癥颗粒对肝硬化大鼠体重和肝、脾湿重及肝脏指数、脾脏指数的影响 模型组大鼠体重较正常组明显下降(P<0.01),肝、脾湿重及肝脏指数、脾脏指数较正常组明显升高(P<0.01)。给药治疗后,高剂量组大鼠体重明显上升,与模型组比较具有显著性差异(P<0.05),低剂量组和对照组大鼠体重与模 WP=6 型组比较无明显差异(P>0.05)。高、低剂量组和对照组大鼠肝湿重较模型组明显下降(P<0.01或P<0.05), 3组间比较差异不显著(P>0.05)。高剂量组大鼠脾湿重较模型组明显下降(P<0.01),低剂量组和对照组与模型组比较无明显差异(P>0.05)。 高、低剂量组和对照组肝脏、脾脏指数较模型组明显下降(P<0.01或P<0.05),其中高剂量组肝脏、脾脏指数与低剂量组比较有显著性差异(P<0.05),存在明显量效关系,高剂量组肝脏指数明显低于对照组,组间比较有显著性差异(P<0.01), 2 柔肝消癥颗粒对肝硬化大鼠血清ALT、AST、TP、Alb含量的影响 模型组大鼠血清ALT、AST含量较正常组明显升高(P<0.01),TP、Alb含量较正常组明显降低(P<0.01)。给药治疗后,各治疗组血清ALT、AST含量均低于模型组(P<0.01),TP、Alb含量均高于模型组(P<0.01)。其中高剂量组ALT含量和对照组ALT、AST含量与低剂量组比较有显著性差异(P<0.01),柔肝消癥颗粒对ALT含量的影响有明显的量效关系。而高、低剂量组和对照组血清TP、Alb含量,组间比较经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。 3 柔肝消癥颗粒对肝硬化大鼠肝组织病理形态学改变和胶原纤维增生程度的影响 (1)柔肝消癥颗粒对肝硬化大鼠肝组织病理形态学改变的影响:肉眼观察正常组大鼠肝脏柔软,红润,被膜光滑;模型组大鼠肝脏体积有所增大,质地变硬,色黯红,切面可见多有小结节;高、低剂量组和对照组肝脏体积、质地、色泽均明显改善,接近正常组,与模型组比较有明显差别。光 WP=7 镜观察正常组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,肝细胞排列规则成索状,在中央静脉周围呈放射状分布,肝血窦结构清晰,无异常改变,肝细胞呈多边形,胞浆均匀,细胞核形态正常;模型组大鼠肝小叶正常结构消失,间质内弥漫性淋巴细胞浸润,肝细胞体积明显增大,局部肝细胞出现严重的脂肪变性,可见到再生的肝细胞(双核),肝间质广泛纤维组织增生,将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成);高剂量组可见正常肝小叶,少数肝小叶结构亦受损,少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞,较少炎性细胞浸润,少量纤维组织增生,但未见形成间隔。低剂量组肝小叶结构被破坏


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