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关节软骨损伤与修复的动物实验及临床研究

赵振拴  
【摘要】: 目的:①探讨利用组织工程学方法,以体外培养的骨髓基质干细胞(BMSCs)复合聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)修复兔膝关节软骨缺损的可行性。 ②评价软骨下骨钻孔法、自体骨软骨移植(Mosaicplasty)及自体骨软骨联合骨髓基质干细胞(BMSCs)-蛋白纤维凝胶移植三种方法修复大面积全层关节软骨缺损的生物力学特性和修复组织细胞的凋亡状况,分析三种治疗方法效果的差异,通过动物实验为临床应用提供依据。 ③评估从同侧膝关节非负重面获取骨软骨柱,行自体骨软骨移植修复距骨穹窿局限性软骨或骨软骨缺损的临床治疗效果。 方法:①获取并分离28只新西兰白兔的骨髓基质干细胞BMSCs,体外培养扩增、诱导分化,用PLGA三维载体材料负载,移植于膝关节软骨缺损区,术后12w和24w分别进行大体观察、光镜观察包括HE染色和甲苯胺蓝染色、采用SABC法行Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色、采用二甲基亚甲蓝分光法行糖氨多糖(GAG)含量检测、Ⅱ型胶原的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测等,评价修复关节软骨缺损的效果。 ②采用析因实验设计将48只新西兰白兔分成6组,在股骨内髁负重区中心制造约直径5mm大小的全层关节软骨缺损,分别采用软骨下骨钻孔法、自体骨软骨移植及自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶移植修复,于术后12w和24w分别作大体观察、原位末端标记TUNEL法检测软骨细胞凋亡计数、ELISA法分析软骨细胞内caspase-3蛋白酶活性、检测平均最大抗拉强度及最大断裂应变等指标,所得的数据采用统计学的方差分析,评价三种方法的差异情况。 ③本组有23例距骨穹窿局灶性骨软骨病损的患者,年龄为16—49岁,平均33岁;男15例,女8例。包括创伤后软骨缺损11例,剥脱性骨软骨炎9例和局灶性骨关节炎3例。属于Berndt和Harty的骨软骨损伤分期Ⅱ期—Ⅳ期。软骨缺损位于距骨穹窿,外侧9例,内侧14例,呈局灶性,缺损的面积平均为1.6 cm~2(范围0.7—3.5cm~2),深度是全层软骨或骨软骨损伤。踝关节镜下明确缺损的部位、大小,行踝关节镜下或关节有限切开移植,清创缺损区后钻孔,自同侧膝关节非负重区钻取骨软骨小柱,利用骨软骨自体移植系统(OATS)的专用器械,采取压配固定技术将移植物植入受区的孔中,作单柱或多柱镶嵌式移植修复距骨软骨缺损。用标准“VAS”视觉模拟标尺评估手术前后踝关节疼痛程度(0—10);用角度测量器测量踝关节的屈伸角度以确定其活动范围ROM即跖屈与背伸度数之和;按Mazur等方法作手术前后踝关节踝关节整体评价(0—100分);根据美国足踝矫形外科学会AOFAS踝-后足评分系统进行手术前后相关因素(性别、年龄、致病原因及软骨缺损面积)组间疗效比较(0—100分);按美国特种外科医院HSS膝关节评分系统评价膝关节整体情况,进行手术前后膝关节功能比较(0—100分)。手术前后疗效比较、手术前后膝关节功能比较采用配对t检验,以P0.05为差异有统计学意义。手术前后相关因素组间疗效比较采用独立样本t检验,以P0.05为差异有统计学意义。 结果:①修复组织的HE染色及甲苯胺蓝染色: BMSCs复合PLGA移植组软骨缺损区由透明软骨组织填充,软骨细胞形状、排列情况,与正常关节软骨细胞类似,软骨细胞外基质染色趋于正常,软骨和软骨下骨修复良好;而对照组缺损区组织学观察绝大部分由纤维结缔组织修复,细胞形态差、排列不规则,关节表面不完整,缺损区周围正常关节软骨出现退变情况。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:术后24w时实验组修复组织中细胞呈圆形或椭圆形,形体大致柱状排列,与周围软骨及软骨下骨整合良好,细胞质和细胞外间质中Ⅱ型胶原染色阳性,出现大量黄褐色或棕黄色颗粒;空白对照组术后各时间点在缺损区修复组织未出现黄染的阳性细胞。修复组织的GAG含量:实验组术后12w为8.52±0.64mg/L,对照组为1.46±0.12 mg/L;实验组术后24w修复组织GAG含量为19.65±1.68 mg/L,对照组为2.67±0.31 mg/L,两组比较其差异有统计学意义(F=125.33,P0.001),表明BMSCs复合PLGA移植组的GAG含量明显高于对照组。RT-PCR检测:实验组有明显的Ⅱ型胶原表达和极强的蛋白聚糖表达,表明BMSCs复合PLGA移植组系透明软骨修复;而对照组有较强的Ⅰ型胶原表达,较弱的蛋白聚糖表达,Ⅱ型胶原表达极弱,表明其为纤维性组织。总之,BMSCs复合PLGA移植修复组织有正常的关节软骨细胞、大量的Ⅱ型胶原和较高的GAG含量,综合所有结果提示其符合透明软骨的特点。 ②三种方法术后修复组织的退变情况:各组用TUNEL法检测软骨细胞凋亡计数及ELISA法检测caspase-3蛋白酶活性,其数值越高者越容易退变,术后12w软骨细胞凋亡计数软骨下骨钻孔组(A组)为4.26±0.92个/高倍视野,自体骨软骨移植组(B组)为2.73±0.67个/高倍视野,自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶复合物移植组(C组)为1.64±0.58个/高倍视野;caspase-3蛋白酶活性A组为39.58±1.25%,B组为24.48±1.03%,C组为18.86±0.94%;术后24w时A组为11.08±2.02个/高倍视野,B组为6.35±1.65个/高倍视野,C组为4.11±0.97个/高倍视野;caspase-3蛋白酶活性A组为83.64±4.50%,B组为56.66±3.18%,C组为35.72±2.23%,数值大小顺序表现为钻孔组自体骨软骨移植组自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶移植组,其差异有统计学意义(P0.01)。修复组织力学指标:自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶复合物移植组(C组)修复软骨组织的应力-应变曲线呈非线性指数曲线关系,在低应力状态下,瞬时应变的值较小,随着应力的增大,瞬时应变的值越来越大;自体骨软骨移植组(B组)应力-应变曲线的非线性指数曲线关系不典型,瞬时应变的值低于C组;软骨下骨钻孔组(A组)应力-应变曲线形状稍低平,接近于直线变化,瞬时应变的值明显低于C组、B组。而平均最大抗拉强度及最大断裂应变数值越高其力学性能越好,术后12w最大抗拉强度A组为1.12±0.11Mpa,B组为2.52±0.08Mpa,C组为3.34±0.26Mpa;术后24w最大抗拉强度A组为1.36±0.08Mpa,B组为2.89±0.03Mpa,C组为4.02±0.18Mpa;术后12w平均最大断裂应变A组为2.52±0.17%,B组为3.56±0.14%,C组为4.15±0.22%;术后24w平均最大断裂应变A组为2.47±0.06%,B组为3.84±0.18%,C组为4.51±0.05%,均值顺序呈现自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶移植组自体骨软骨移植组钻孔组,各组间有显著性差异(P0.001)。经过两两比较的统计学方差分析,可以得出三种修复方法在生物力学、软骨细胞凋亡方面有显著性差异,比较的结果是:自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶复合物移植优于自体骨软骨移植组及钻孔组,而自体骨软骨移植组优于钻孔组。经过析因实验的统计学分析,表明本实验的自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶复合物移植在手术后24周取得最佳效果。综合结果表明自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶移植适宜大面积软骨缺损,而软骨下骨钻孔法、单纯Mosaicplasty移植不适合。 ③所有患者术后随访15—30个月,平均22.6±8.4个月。评估踝关节疼痛程度,VAS得分从术前平均4.9±1.21降至术后0.8±0.13,差异有显著性(t=19.53,P0.001)。踝关节活动范围由术前平均44°±5.8°增加到术后65°±11.2°,其差异有显著性(t=15.46,P0.001)。按Mazur等方法综合评定踝关节的状况,评分从术前平均51±8.6分提高到92±6.3分,差异有显著性(t=27.05,P0.001)。术后MRI检查提示修复的关节面平滑,移植物与周围组织结合良好。根据AOFAS评分手术前后相关因素组间疗效比较,年龄≥35岁改变值为38.26±1.45分,年龄35岁改变值为42.50±0.27分,差异有显著性(t=3.02,P0.01);缺损面积≥1.5c㎡改变值为39.71±1.11分,缺损面积1.5c㎡改变值为42.88±0.84分,差异有显著性(t=3.54,P0.01),表明自体骨软骨移植的手术疗效与患者的年龄、缺损面积存在明显的相关性。同样经统计学分析,自体骨软骨移植的手术疗效与患者的性别因素、致病原因因素相关性不明显,其差异不存在统计学意义(P0.05);按HSS评分标准评价膝关节情况,术前平均94.3±5.2分,末次随访时平均为93.1±6.7分,差异无统计学意义(t=1.84,P0.05),说明手术前后膝关节功能无改变,即从同侧膝关节非负重区获取骨软骨移植柱,对整个关节的功能无影响。 结论:①以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物载体材料负载BMSCs移植可以形成透明软骨修复兔膝关节软骨缺损。 ②采用自体骨软骨联合BMSCs-蛋白纤维凝胶移植修复大面积软骨缺损取得很好的效果,相比之下,自体骨软骨移植和软骨下骨钻孔法疗效较差。 ③通过同侧膝关节行骨软骨移植治疗距骨局限性软骨或骨软骨缺损是一种疗效明显的外科治疗方法。


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