硫化氢在大鼠内毒素休克发生发展中的作用及其对一氧化氮和一氧化碳的影响

【摘要】： 内毒素休克(endotoxic shock,ES)多由革兰氏阴性杆菌内毒素引起,血管调节功能失调、血管扩张引起的低血压及全身炎症反应导致的器官组织损伤为其主要的临床病理过程。内毒素主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活或诱发各种内源性炎症介质如补体、激肽及多种细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等。以往实验证明许多炎症介质本身即是血管活性物质,是参与休克发生发展的主要因素。然而内毒素休克时,循环衰竭器官组织炎症性损伤的确切发病机制尚未阐明,且在临床治疗上仍是一个非常棘手的问题。近年来,随着分子生物学研究进展,发现小分子气体如一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)在休克时含量增高,对血压调节和血管舒张起重要作用。但内毒素休克时低血压状态发生的确切机制仍未完全阐明,大量的研究表明,内毒素休克时严重低血压的形成并非完全由于此时大量诱导生成的NO和CO所致,而且NO、CO在内毒素休克组织炎症反应的发生发展过程中具有“双面刃”作用。选择性抑制NO的产生(应用诱生型NO合酶抑制剂)能减轻内毒素引起的组织炎症性损伤,而完全抑制NO、CO的产生虽能使内毒素休克动物血压升高,但并未能降低内毒素休克动物的死亡率和延长其存活时间,甚至是相反的结果。九十年代中叶,人们发现在体内半胱氨酸代谢过程中生成小分子气体硫化氢(hydrogen sulfide,H2S),对神经系统特别是海马功能具有调节作用,且可以调节消化道和血管平滑肌张力,其生物学作用类似NO和CO。H2S作为内毒素休克时一系列病理生理反应中的一种新的内源性介质,已开始受到人们的重视。目前,内源性H2S的生理与病理意义远未阐明,其在内毒素休克中的病理生理作用研究较少且尚存在争议。有研究报道H2S生成增多导致了内毒素休克低血压和组织炎症性损伤的发生,抑制H2S产生后可改善低血压和组织损伤。但也有研究认为H2S具有组织保护作用,如Yuka等认为内源性H2S可通过增加谷胱甘肽的生成来保护神经元免受氧化损伤;Bian的研究显示H2S在缺血性心肌损伤中发挥细胞保护作用;Fiorucci等人证实H2S通过改善胃的微循环可减轻抗炎性非甾体类药物引起的胃损伤。 因此,本研究在建立内毒素休克大鼠模型的基础上,观察血浆中H2S含量的变化与低血压、组织炎症性损伤的关系,从而证实H2S在内毒素休克时的确切作用;观察H2S在内毒素休克发生发展中的作用与NO、CO的关系,旨在探讨H2S在内毒素休克发生发展中的作用及其机制,以期进一步揭示内毒素休克的发病机制。 1内毒素休克大鼠模型的建立 内毒素休克(endotoxic shock,ES)是一个以急性微循环障碍为主的常见临床危重病症,死亡率极高。因此,如何防治内毒素休克的发生是重症医学所关注并亟待解决的重大课题。在本研究中,我们试图阐明其发病机制,为此需制备较稳定的ES动物模型。革兰氏阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是内毒素休克的首要原因,本部分实验通过静脉注入LPS复制内毒素休克模型。 Wistar大鼠64只,随机分成三组:①对照组(n=18):经静脉注入生理盐水(1 ml/kg);②小剂量LPS组(n=22):经静脉注入LPS 5 mg/kg(LPS 5 mg/ml,1 ml/kg);③大剂量LPS组(n=24):经静脉注入LPS 10 mg/kg(LPS 10 mg/ml,1 ml/kg)。连续监测生理盐水、LPS注入后6 h内的平均动脉压(MAP)、心率变化;并于生理盐水、LPS注入后不同时间点(30, 60, 90 min, 2, 3, 4, 6 h)留取血浆,测定血浆中的TNF-α含量;实验结束后计算各组大鼠的存活率(LPS注入6 h后未死亡者计为存活)。 结果发现:①大鼠的基础血压(给药前)在三组之间无显著差异(P 0.05)。在6 h实验过程中,对照组大鼠MAP无明显变化,维持在110±5 mmHg ~106±9 mmHg范围内。大剂量LPS(10 mg/kg)组大鼠MAP迅速下降,但15 min内回升至正常(考虑为应激性反应),并维持60 min左右,然后逐渐缓慢下降,并呈进行性持续性降低,4 h接近最低水平(69±4 mmHg),一直维持到6 h,均明显低于同时间点对照组的血压(P均 0.01)。小剂量LPS(5 mg/kg)组大鼠注入LPS后3 h内MAP没有明显的变化,3 h后开始缓慢下降,4 h时明显下降,6 h接近最低水平。②大剂量LPS(10 mg/kg)组大鼠注入LPS后心率短暂减慢,随后逐渐回升至正常(考虑为应激性反应),并维持30 min左右,于90~120 min后逐渐缓慢减慢,直至死亡。另外存活时间长的大鼠心率回升幅度大,存活时间短者心率多无明显回升。对照组和小剂量LPS(5 mg/kg)组心率短暂加快后有所减慢。③对照组全部存活,大剂量LPS(10 mg/kg)组存活率为66.67%(16/24,P 0.05 vs对照组),小剂量LPS(5 mg/kg)组存活率为90.91%(20/22)。大鼠最短存活时间3.5 h。④两个剂量的LPS组大鼠血浆中TNF-α含量均于注入LPS后逐渐上升(P均 0.05 vs对照组),60 min明显上升(P均 0.05 vs对照组),90 min达高峰(P均0.01 vs对照组),然后逐渐下降,均于3 h接近正常水平(P均 0.05 vs对照组)。小剂量组TNF-α上升幅度高于大剂量组。对照组各时间点TNF-α均未测出。 结果提示:本部分实验通过静脉注入大剂量LPS的方法成功复制了内毒素休克动物模型。应用LPS建立的感染性休克动物模型MAP、心率变化与临床感染性休克相似,是一个理想的模型。 2内毒素休克大鼠血浆和主要器官中硫化氢含量的变化和意义 2.1内毒素休克大鼠血浆中硫化氢含量的变化和意义 内毒素休克多由革兰氏阴性杆菌内毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起,以血管调节功能失调,血管扩张致低血压为主要临床表现。近年来,随着分子生物学研究进展,发现小分子气体如一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)在休克时含量增高,对血压调节和血管舒张起重要作用。但ES时低血压状态发生的确切机制仍未完全阐明,大量的研究表明,ES时严重低血压的形成并非完全由于此时大量诱导生成的NO和CO所致,其中体内半胱氨酸代谢过程中生成的小分子气体硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)作为感染性休克时一系列病理生理反应中的一种新的内源性介质,已开始受到人们的重视。目前,内源性H2S的生理与病理意义远未阐明,其在ES中的病理生理作用研究较少且报道不一。本研究在建立内毒素休克大鼠模型的基础上观察了血浆中H2S含量的变化,以探讨H2S在内毒素休克低血压发生中的作用。 Wistar大鼠96只,每组24只。实验分为:①正常对照组:经静脉注入生理盐水(1 ml/kg);②LPS组:经静脉注入LPS(10 mg/ml,1 ml/kg);③LPS+硫氢化钠(NaHS,H2S供体)组:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS(28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水);④LPS+炔丙基甘氨酸(PPG,H2S代谢酶抑制剂)组:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG(45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水)。连续监测生理盐水、LPS注入后6 h内的MAP和心率的变化;并于生理盐水、LPS注入后不同时间点经股动脉(30, 60, 90 min, 2, 3, 4, 6 h)留取血浆测定H2S含量。 结果如下:①大鼠的基础血压(给药前)在4组之间无显著差异(P 0.05)。在6 h实验过程中,对照组大鼠MAP无明显变化,维持在110±5 mmHg ~106±9 mmHg范围内。LPS组大鼠MAP迅速下降,但15 min内回升至正常(考虑为应激性反应),并维持60 min左右,然后逐渐缓慢下降,90 min时血压明显降低(81±3 mmHg)并呈进行性持续性降低,4 h接近最低水平(69±4 mmHg),一直维持到6 h,均明显低于同时间点对照组的血压(P均 0.01)。LPS+PPG组MAP在90 min(97±5 mmHg),4 h(92±6 mmHg),6 h(88±7 mmHg)均显著高于同时间点的LPS组(P 0.05或P 0.01);与同时间点的LPS组相比,LPS+NaHS组MAP值在90 min(74±6 mmHg),4h(51±5 mmHg),6h(43±4 mmHg)均更为降低(P 0.05或P 0.01)。②LPS组大鼠注入LPS后心率短暂减慢,随后逐渐回升至正常(考虑为应激性反应),并维持30 min左右,于90~120 min后逐渐缓慢减慢,直至死亡,LPS+NaHS组与同时间点的LPS组相比,心率减慢明显(3、4、6 h,P 0.05)。对照组和LPS+PPG组心率短暂回升后有所减慢。③LPS组大鼠血浆H2S含量呈增高趋势,注入LPS后4 h较对照组增高,6 h明显增高(P均 0.05),且LPS大鼠血浆中H2S含量(注入LPS后4、6 h)与血压呈显著负相关关系,其相关系数分别为-0.973和-0.986(P均 0.05);LPS+PPG组大鼠血浆H2S含量较相应时间点(注入LPS后4、6 h)的LPS组明显降低(P 0.05);LPS+NaHS组大鼠血浆中H2S含量明显高于相应时间点(注入LPS后4、6 h)的LPS组(P均 0.05)。 以上结果提示,内毒素休克大鼠严重低血压发生的部分原因是由于H2S生成增多所致。 2.2内毒素休克大鼠主要器官中硫化氢含量的变化和意义 我们已在前面的实验中证实内毒素休克大鼠严重低血压发生的部分原因是由于H2S生成增多所致。本实验通过观察大鼠主要器官组织中H2S含量的变化及其与内毒素休克组织损伤的关系,进一步探讨H2S在内毒素休克的病理生理调节机制中的作用。将154只雄性Wistar大鼠随机分为四组:①正常对照组(n=28):经静脉注入生理盐水(1 ml/kg);②LPS组(n=50):经静脉注入LPS(10 mg/kg, 10 mg/ml);③LPS+硫氢化钠(NaHS,H2S供体)组(n=38):注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS(28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水);④LPS+炔丙基甘氨酸(PPG,H2S代谢酶抑制剂)组(n=38):注入LPS前30 min经腹腔注入PPG(45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水)。于生理盐水、LPS注入后不同时点分别留取血清、血浆、脾脏(0 h、2 h、4 h、6 h)及心、肝、肺、肾(6 h)等主要器官组织。检测各组织中MDA含量、MPO活性、硫化氢合酶活性和H2S含量;检测血清乳酸脱氢酶、转氨酶及血浆尿素氮、肌酐水平;检测脾脏组织中IL-1β、IL-6含量;测定动脉血氧分压(PaO2)并观察各组织的形态学变化。 结果如下:①与对照组相比,LPS注入6 h组心、肝、脾、肺、肾各组织中MDA含量、MPO活性均明显增高(P均 0.01);与LPS组相比,LPS+PPG组各组织中MDA含量、MPO活性均明显降低(P均 0.01),而LPS+NaHS组各组织中MDA含量、MPO活性较LPS组均明显增高(P均 0.01)。②LPS组较对照组大鼠血清中LDH和ALT活性显著增高(P均 0.05);与LPS组相比,LPS+PPG组大鼠血清中LDH和ALT活性较明显降低(P均 0.05);LPS+NaHS组大鼠血清中LDH和ALT活性明显高于相应时间的LPS组的变化(P均 0.05)。③对照组大鼠脾脏组织中IL-1β的浓度低于检测的下限,IL-6浓度为54.03±6.57 ng/L。大鼠脾脏组织中细胞因子(IL-1β、IL-6)的浓度随着LPS刺激时间的延长而升高,与对照组相比,LPS组各时间点的大鼠脾脏组织中IL-1β、IL-6的浓度均有显著差异(P均 0.05)。IL-1β及IL-6的浓度分别于注入LPS后2 h、4 h达到高峰,IL-1β、IL-6的浓度分别为342.14±14.89 ng/L及4022.76±39.72 ng/L。PPG预注入(LPS+PPG组)可使大鼠脾脏组织中IL-1β(2 h)、IL-6(4 h)的浓度较同时间点LPS组的相应浓度分别降低86.9%、62.8%(P均 0.05),但均仍高于对照组(P均 0.05 vs对照组);NaHS预注入(LPS+NaHS组)可使大鼠脾脏组织中IL-1β(2 h)、IL-6(4 h)的浓度较同时间点LPS组的相应浓度分别增高86.9%、62.8%(P均 0.05)。④与对照组相比,LPS组大鼠PaO2显著降低(P均 0.05);LPS+PPG组较LPS组大鼠PaO2明显增高(P均 0.05);LPS+NaHS组大鼠PaO2明显低于相应时间点的LPS组的变化(P均 0.05)。⑤给药前各组间血浆BUN和Cr无显著性差异;给药后,LPS组2 h、4 h、6 h血浆BUN和Cr含量均显著升高(P均 0.05);与LPS组相比,LPS+PPG组4 h、6 h血浆BUN和Cr含量均明显减少(P均 0.05),LPS+NaHS组4 h、6 h血浆BUN和2h、4h血浆Cr含量明显升高,且均有显著性差异(P均 0.05)。⑥LPS组较对照组大鼠心、肝、脾、肺、肾各组织中H2S含量及硫化氢合酶活性显著增高(P均 0.05);LPS+PPG组较LPS组大鼠组织中H2S含量及硫化氢合酶活性明显降低(P均 0.05);LPS+NaHS组大鼠组织中H2S含量及硫化氢合酶活性明显高于相应时间点LPS组的变化(P均 0.05)。⑦对照组心、肝、脾、肺、肾各组织结构无异常改变。LPS注入后,各组织均可见明显的损伤性变化,主要表现为细胞肿胀和细胞间质水肿,细胞间大量炎性细胞浸润;PPG可明显减轻LPS所致的各组织中细胞及间质水肿和炎性细胞浸润;而NaHS可加重各组织损伤。 结果提示内毒素休克大鼠组织炎症损伤的发生与H2S生成增多密切相关。 3硫化氢在内毒素休克中的作用与一氧化氮的关系 我们前面的研究发现,内毒素休克时低血压及此时由于炎症导致的组织损伤的部分原因是由于内源性H2S生成增多引起的。我们课题组以往的研究发现,在LPS所致的急性肺损伤模型中,内源性H2S生成不足、NO大量产生可能是肺损伤发生的机制之一;外源性H2S的抗组织损伤作用可能与其抑制iNOS活性,减少NO的大量产生有关。但是H2S在内毒素休克中的作用与NO有何关系报道较少且尚有争议。在本部分实验中我们将组织代谢生成H2S的关键酶[(胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase, CSE)]的抑制剂炔丙基甘氨酸(propargylglycine,PPG)及外源性H2S供体NaHS应用于内毒素大鼠,观察H2S对内毒素休克大鼠NOS/NO体系的影响,以探讨H2S在内毒素休克中的作用与NO的关系。32只雄性Wistar大鼠随机分为四组:①正常对照组:经静脉注入生理盐水(1 ml/kg);②LPS组:经静脉注入LPS(10 mg/kg);③LPS+硫氢化钠(NaHS,H2S供体)组:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS(28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水);④LPS+炔丙基甘氨酸(PPG,H2S代谢酶抑制剂)组:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG(45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水)。于生理盐水、LPS注入后6 h分别留取心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织。应用试剂盒测定各组织中NOS活性和NO含量;采用免疫组织化学和Western blot方法检测各组织中iNOS的表达。 结果如下:①与对照组相比,LPS组心、肝、脾、肺、肾各组织中iNOS活性和NO含量均明显增高(P 0.05或P 0.01);LPS+PPG组较LPS组各组织中iNOS活性和NO含量均明显降低(P 0.05或P 0.01);而LPS+NaHS组较LPS组各组织中iNOS活性和NO含量均明显增高(P 0.05或P 0.01)。②LPS组较对照组各组织中eNOS活性明显降低(P均 0.05); LPS+PPG组较LPS组各组织中eNOS活性增高(P均 0.05);NaHS+LPS组各组织中eNOS活性明显低于LPS组相应变化(P均 0.05)。③应用iNOS特异性抗体对各组织进行免疫组织化学细胞定位检测。结果显示,正常对照组各组织中未见HO-1蛋白表达的阳性棕黄色颗粒,LPS组各组织中出现iNOS蛋白表达的阳性信号,主要分布在炎症细胞及各组织的实质细胞以及血管平滑肌细胞等的胞浆内;PPG可使LPS诱导的iNOS蛋白表达减少;NaHS可使LPS诱导的iNOS蛋白表达增多。④各组织iNOS的Western blot检测结果进行信号密度扫描后显示,与对照组相比,LPS可使各组织中iNOS蛋白表达增多(P均 0.05);PPG可使LPS诱导的iNOS蛋白表达减少(P 0.05或P 0.01);NaHS可使LPS诱导的iNOS蛋白表达增多(P均 0.05)。 以上结果提示:H2S可使eNOS活性下降,iNOS活性升高及随后产生的大量NO,此可能与H2S导致内毒素休克及休克时的组织损伤有关。 4硫化氢在内毒素休克中的作用与一氧化碳的关系 近年来大量的研究表明,内毒素休克严重低血压的形成及组织的炎症损伤并非完全由于iNOS诱导生成的NO所致,其中血红素氧合酶-1/一氧化碳(heme oxygenase-1/carbon monoxide,HO-1/CO)系统作为感染性休克一系列病理生理反应中的内源性介质也已逐渐为人们所重视。我们前面的研究发现,内毒素休克时的低血压及此时由于炎症导致的组织损伤的部分原因是由于内源性H2S生成增多引起的。可见,迄今发现的三种内源性气体信号分子,即NO、CO和H2S均参与了内毒素休克的发生。第三部分的实验已证实,H2S在内毒素休克过程中的作用与NO有关。那么在此过程中,H2S的作用与HO-1/CO有无联系、H2S对HO-1/CO有无作用呢?本部分实验将观察内毒素休克时H2S对HO-1/CO的影响。 将64只雄性Wistar大鼠随机分为四组:①正常对照组:经静脉注入生理盐水(1 ml/kg);②LPS组:经静脉注入LPS(10mg/kg, 10 mg/ml);③LPS+硫氢化钠(NaHS,H2S供体)组:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS(28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水);④LPS+炔丙基甘氨酸(PPG,H2S代谢酶抑制剂)组:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG(45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水)。于生理盐水、LPS注入后不同时间点自股动脉分别留取肝素抗凝的血液(0, 30, 60, 90 min, 2, 3, 4, 6 h)和心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织(6 h)。测定血液和各组织中CO含量;采用免疫组织化学和Western blot方法检测各组织中HO-1蛋白的表达。 结果如下:①与对照组相比,LPS组血液和各组织中CO含量均明显增高(P均 0.05);LPS+PPG组较LPS组血液和各组织中CO含量均明显降低(P均 0.05);而LPS+NaHS组较LPS组血液和各组织中CO含量均明显增高(P均 0.05)。②应用HO-1特异性抗体对各组织进行免疫组织化学细胞定位检测。结果显示,正常对照组各组织中未见HO-1蛋白表达的阳性棕黄色颗粒,LPS组各组织中出现HO-1蛋白表达的阳性信号,主要分布在炎症细胞及各组织的实质细胞以及血管平滑肌细胞等的胞浆内;PPG可使LPS诱导的HO-1蛋白表达减少;NaHS可使LPS诱导的HO-1蛋白表达增多。③各组织HO-1的Western blot检测结果进行信号密度扫描后显示,与对照组相比,LPS可使各组织中HO-1蛋白表达增多;PPG可使LPS诱导的HO-1蛋白表达减少;NaHS可使LPS诱导的HO-1蛋白表达增多(P均 0.05)。结果提示H2S可上调内毒素休克大鼠HO-1/CO通路。但HO-1/CO上调的确切机制和在休克中的作用还有待阐明。 结论 本研究在建立内毒素休克大鼠模型的基础上从整体和分子水平较为系统地观察了H2S在内毒素休克发生发展中的作用及其对NO和CO的影响。探讨了H2S在内毒素休克发生发展中的作用及其机制,为进一步揭示内毒素休克的发病机制提供了实验依据。 1通过静脉注入大剂量LPS的方法成功复制了内毒素休克动物模型。应用LPS建立的感染性休克动物模型MAP、心率变化与临床感染性休克相似,是一个理想的模型。 2内毒素休克大鼠严重低血压和组织炎症损伤的发生与H2S生成增多有关。 3首次发现H2S可使内毒素休克大鼠组织中eNOS活性下降,iNOS活性升高及随后产生的大量NO,该作用可能与H2S导致内毒素休克及休克时组织的炎症损伤有关。 4首次发现H2S可上调内毒素休克大鼠组织中的HO-1/CO通路。但HO-1/CO上调的确切机制和在休克中的作用还有待阐明。