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抗偏头痛中药安天胶囊的研究和开发及天然植物中活性成分的分离和研究

付焱  
【摘要】: 头痛是一种常见疾病,随着现代生活节奏的加快,人群中头痛的发病率呈上升的趋势,严重影响患者的生活质量和工作。头痛发病机制复杂,其作用机制尚不十分清楚。目前,国内外临床治疗头痛主要用解热镇痛药、麦角生物碱、非甾体抗炎药和5-HT受体激动剂对症治疗,并辅以中枢镇静药缓解病情。中草药在我国医疗保健中已有数千年的应用历史,中药安天的开发源于《太平圣惠方》,由旋覆花和牛蒡子两味中草药组成的处方。此两种中药的总提物经扭体药理试验均表现出显著的镇痛活性。本课题采用现代化的手段,着眼于中药有效成分的研究与开发,发掘传统中药的精华。 菊科植物旋覆花为我国药典收载的药用植物,作为常用中药,具有降气、消痰,行水,止呕的功效。旋复花属植物含有甾醇、倍半萜、香豆素、及类黄酮等化学成分,这些成分的生物活性研究表明旋覆花主要用于治疗支气管炎、肝炎、关节炎和抗肿瘤等。其中对倍半萜内酯化合物抗肿瘤及抗炎活性研究报道较多,但未见有关旋覆花治疗头痛及镇痛作用活性成分的报道。欧亚旋覆花广泛分布在我国东北、内蒙古、新疆等地,但尚未见欧亚旋覆花作为旋覆花药材使用的先例。欧亚旋覆花乙醇提取物,经扭体、热板、甩尾和福尔马林舔足药理试验均证明本品总提取物有镇痛作用,低剂量抑制炎性疼痛,高剂量既抑制炎性疼痛又抑制神经疼痛。这是迄今为止第一次发现此草药中具有镇痛作用。本研究采用系统提取分离手段,建立了欧亚旋覆花多糖的提取制备及含量测定方法;制备了该药材挥发油并对其成分进行了GC-MS分析;分离、制备并确定了该草药的镇痛活性部位及有效成分,为研究并发现新化学结构类型的镇痛药物以及今后对这一草药的研究性开发提供实验依据。 攻克癌症是21世纪医学研究的主要目标之一,而目前临床采用的绝大多数抗肿瘤药物为化学合成品。用于抗肿瘤治疗的天然产物及其半合成代用品虽然为数不多,但一直是抗肿瘤药物研究和开发的热点。紫杉醇是当今临床最好的治疗卵巢癌的药物,自1992年美国FDA批准上市用于卵巢癌和乳腺癌的治疗后,其应用范围现扩展到皮肤、肺、脑和颈部等恶性肿瘤。阻碍紫杉醇临床抗肿瘤应用的主要障碍是天然来源匮乏。紫杉醇在红豆杉树木中的含量很低,收率也仅有0.006~0.007%。为此,保护药用资源,避免耗竭,研究、寻找其天然或半合成代用品是该领域的重点之一。日本红豆杉(Taxus cuspidata)的研究始于二十世纪六十年代,已有超过200个倍半萜类紫杉烷成分发现并报道,其中包括紫杉醇和紫杉醇半合成原料10-DAB。1992年在加拿大红豆杉(Taxus canadenes)针叶中发现一紫杉烷成分的化学结构与紫杉醇的骨架结构近似,并以此化学成分为原料合成了紫杉醇。在加拿大魁北克省也生长着常青灌木日本红豆杉。本研究对加拿大产日本红豆杉针叶的紫杉烷成分进行了研究,分析其作为紫杉醇类抗肿瘤药新天然来源的可行性。 第一部分抗偏头痛中药安天胶囊的制备工艺研究 目的:在已有的药理活性研究基础上,建立安天胶囊剂制备工艺,克服水煎剂的剂量标准不明确,服用、携带不便等缺点。 方法:⑴提取方法:欧亚旋覆花醇提水沉;牛蒡子水提醇沉。滤液合并,制粉装胶囊。⑵工艺条件优化:采用正交试验,以浸膏得率、有效成分含量及扭体抑制率等为指标,考察提取溶剂、提取时间和次数等关键因素。⑶优选的制备工艺经中试放大,验证工业化生产的可行性。 结果:旋覆花提取工艺为10倍量95%乙醇提取三次,每次一个小时,醇提液浓缩后,水沉除杂。牛蒡子提取工艺为10倍量水提取三次,每次一个小时,浓缩水提液用90%乙醇醇沉除杂,滤液合并干燥制粉装胶囊。 结论:本研究在传统中药汤剂的基础之上,通过合理的实验设计对新中药制剂的制备工艺进行了筛选和优化。采用有效成分和药理学试验双重控制因子,对生产工艺立体监控,改进了传统古方的提取方法,创新性采用不同方法,分别提取的新工艺,用现代化定量检测手段规范中药的制备,改善了中药汤剂的不稳定和盲目性,实现了中药的标准化生产。通过正交试验优选出安天胶囊剂的制备工艺,安全有效且稳定性好,成本低廉,已报批国家中药新药。 第二部分欧亚旋覆花中多糖、挥发油、及倍半萜类活性化合物的研究 目的:本研究旨在通过制备欧亚旋覆花多糖、挥发油、镇痛活性部位和倍半萜类活性化合物,建立多糖的制备和含量测定方法;在制备分离挥发油的基础上,用GC-MS对山西运城地区产欧亚旋覆花挥发油进行化学成分分析和鉴定;采用先进的提取分离技术和波谱学鉴定手段,结合镇痛药理试验模型,分离并确定镇痛活性部位及成分,为添补这一草药药学研究上的空白和全方位研究并开发这一古老药用资源奠定实验基础。 方法:⑴欧亚旋覆花多糖:95%乙醇脱脂后,干燥植物用水提取两次,滤液浓缩后,取上清液加无水乙醇沉淀,沉淀物经过滤、洗涤、干燥后得欧亚旋覆花多糖,运用苯酚-硫酸法测定其含量。⑵挥发油:采用水蒸气蒸馏法从欧亚旋覆花中提取挥发油,用归一化法测定成分含量。经过质谱计算机数据系统检索,确定出欧亚旋覆花挥发油中的化学成分。色谱条件:DB-5石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm,膜厚0.25μm);柱温:70℃(保持2min),以10℃/min升到230℃(保持10min);进样口温度250℃;分流比15:1;载气(He)流速为1.0ml/min。⑶镇痛活性部位:干燥的欧亚旋覆花地上部分,用95%乙醇浸提4次,每次2天,滤液减压浓缩,将醇提物悬浮于水中,用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,萃取物经干燥后,经小鼠醋酸扭体实验确定镇痛活性部位。⑷倍半萜类活性化合物:具有镇痛活性的氯仿部分经闪式柱层析和加压柱层析分离制备倍半萜类活性成分,产品化学结构用波谱学方法检测鉴定。 结果:所得多糖样品纯度较高,制备收率为2.7%。该植物的多糖含量较高(20%),含量测定方法可靠,结果令人满意。鉴定了欧亚旋覆花中的62个挥发油成分,大约占总成分的68.4 %,主要成分为2,3,4,5-四氢-1-苯并噁庚英-3-醇(相对含量4.276% )。氯仿部分呈现显著的镇痛作用(P0.01),可与阿司匹林媲美(P0.05)。氯仿部分的活性成分经NMR鉴定为1-氧-乙酰大花旋覆花内酯,生药中分离制备收率为0.075%。 结论:本文首次研究了欧亚旋覆花总多糖和挥发油的制备及分析方法,乙醇-水提取多糖效果较好,苯酚-硫酸法含量测定方法可行。水蒸气蒸馏法制备挥发油,方法稳定可靠,重现性好,适于欧亚旋覆花挥发油化学成分分析,上述产品的生物活性有待今后进一步研究。本文首次报道了欧亚旋覆花的镇痛活性,并深入研究和确定了镇痛活性部位及活性成分,即氯仿部分和1-氧-乙酰大花旋覆花内酯。采用色谱分离技术,以该山西产欧亚旋覆花地上部分为原料建立了该成分作为化学对照品的提取、分离、精制的制备方法,分离制备的1-氧-乙酰大花旋覆花内酯已用于旋覆花新的质量标准研究。作为镇痛活性有效成分该化合物有关抗炎作用的分子生物学研究已发表在国际杂志上,其偏头痛作用机制有待进一步深入研究。作为首次在欧亚旋覆花中发现治疗头痛及镇痛作用活性物质,我们申报了苯并呋喃酮类(即倍半萜内酯类)及其衍生物镇痛作用的国家专利(专利号ZL02117985.9)。 第三部分加拿大魁北克产日本红豆杉针叶中紫杉烷化学成分的研究 目的:本研究以加拿大产日本红豆杉针叶为研究对象,采用先进的提取分离手段和新技术,对其针叶中紫杉烷化学成分进行系统分离和波谱学鉴定,并比较日本产红豆杉针叶中紫杉烷成分的报道,寻找新的化合物并考察该植物作为新的紫杉醇药用资源的可行性。 方法:生长在加拿大魁北克的日本紫杉干燥针叶经粉碎后,室温下用甲醇浸提三次,每次24h,滤液合并浓缩后,浸膏悬浮于饱和盐水中,先用正己烷脱脂,再用二氯甲烷萃取,合并萃取液,经干燥后,减压回收溶剂。二氯甲烷部分的化学成分的分离采用反复柱层析色谱和制备、半制备高效液相色谱等分离手段,薄层层析色谱、分析高效液相色谱和NMR波谱检测手段,分离并鉴定紫杉烷化学成分。 结果:在分离得到的73个单体化合物中,属紫杉烷类的化合物有59个,其中31个紫杉烷类化合物进行了结构鉴定。按分离的先后顺序排列,它们是taxinine(1), 9-deacetyl taxinine (taxinine NN-3,2),taxinine B(3),2-去乙酰氧基-红豆杉素J(4),O-cinnamoyltaxacin I triacetate(5),taxinine A(6),缩环taxinine A(7),9, 10-deacetyltaxinine(8),5-cinnamoyl-9,10-diacetyltaxicin I (2-deacetyltaxinine) ( 9 ), 10-diacetyl taxinine (10),taxuspinanes H(11),yunnanxane(12),5α-cinnamoyloxy- 9α,10β,13α-triacetoxytaxa-4(20),11-diene(13),2,10-diacetyl-5-cinnamoyl- phototaxicin II(14),taxuspines W(15),Taxine B(16),2α,9α,10β,13α- tetraacetoxy-taxa-4(20),11-dien-5α-ol ( 17 ), 1-hydroxytaxuspine C (3,11-cyclotaxinine NN-2,18),10-deacetyl taxinine B(19),taxagifine(20),taxacine(21),20-cinnamoyloxy-5-epi-canadensene(22),taxuspines J ( 23 ), Baccatin IV ( 24 ), 2α,10β-diacetoxy-1β,9α-dihydroxy- 5α-cinnamoyoxy-3,11-cyclotaxa-4(20)-dien-13-one(25),taxuspines F(26),缩环tracetyl-5-decinnamoyltaxicin I( 27 ), 1β,2α,9α,10β-tetrahydroxy- 5α-cinnamoyoxytaxa-4(20),11-dien-13-on(e28),7-epi-10-deacetyltaxo(l29),Taxuspines B(30),Taxezopidine G(31)。 结论:加拿大魁北克产日本红豆杉的紫杉烷成分确实与日本红豆杉存在一定差异,在已鉴定结构的紫杉烷中12个化合物是首次从日本紫杉中分离得到,它们是2-去乙酰氧基-红豆杉素J(4),9, 10-deacetyltaxinine(8),5-cinnamoyl-9,10-diacetyltaxicin I (2-deacetyltaxinine()9),yunnanxane(12),5α-cinnamoyloxy-9α,10β,13α-triacetoxytaxa-4(20),11-diene(13),2,10-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(14),Taxine B(16),10-deacetyl taxinine B(19),20-cinnamoyloxy-5-epi-canadensen(e22),2α,10β-diacetoxy- 1β,9α-dihydroxy-5α-cinnamoyoxy-3,11-cyclotaxa-4(20)-dien-13-one(25),1β,2α,9α,10β-tetrahydroxy-5α-cinnamoyoxytaxa-4(20),11- dien-13-one(28),7-epi-10-deacetyltaxol(29)。缩环taxinine A(7)为在日本紫杉中发现的化学不稳定新型紫杉烷天然产物;缩环tracetyl-5-decinnamoyltaxicin (I27)为首次报道的化学不稳定新化合物,这两个新化合物的化学不稳定性及结构确证尚需进一步深入研究。由此可见,地域和气候对植物化学成分含量及组成是有一定影响的。在加拿大魁北克的日本紫杉针叶中未发现紫杉醇及其半合成原料10-DAB和9-dihydro-13-acetylbaccatin III,因此,该植物针叶不适宜作为紫杉醇抗肿瘤药的天然药用资源。


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