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斑蝥酸钠对人多药耐药K562/AO_2细胞的体外作用及其机制研究

时爱春  
【摘要】: 目的:肿瘤化疗失败的原因往往是多药耐药(MDR)的出现,因此有效地控制MDR的发生已成为肿瘤治疗的关键。目前开发的MDR逆转剂因毒副作用大或作用靶点单一等而无法达到令人满意的程度。中药因资源丰富、低毒、作用靶点多、价格便宜等优点,已成为目前肿瘤MDR逆转剂研究的重点。本研究拟通过体外实验观察中药斑蝥酸钠(SCA)对人多药耐药K562/AO_2细胞是否有逆转作用,并初步探讨该中药逆转MDR的可能机制。 方法:选取经典的耐药细胞系-人多药耐药K562/AO_2细胞株及相应的敏感株K562,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测SCA对K562、K562/AO_2细胞的细胞毒作用,从而选择对两株细胞的杀伤率均10%的浓度作为该药物的无毒剂量。以维拉帕米(VRP)为阳性对照,采用无毒剂量的SCA及VRP分别与阿霉素(ADM)共同作用于K562/AO_2、K562细胞株进行MDR逆转实验;运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析SCA及VRP分别处理K562/AO_2细胞前后mdr1基因的表达水平;应用流式细胞术(FCM)法分析SCA及VRP分别处理K562/AO_2、K562细胞前后,细胞Bcl-2、P-gp蛋白的表达水平,以及处理前后两细胞内ADM的平均荧光强度。 结果:1 MTT结果显示:SCA在(0.05~10)μg/ml浓度范围内能抑制K562细胞和K562/AO_2细胞的体外增殖,且随着浓度增加抑制率相应升高,由回归分析得出,当SCA的终浓度0.11μg/ml时,对两细胞生长无明显抑制作用,本实验选取0.1μg/ml作为无毒剂量。0.1μg/mlSCA及5μg/mlVRP[1]分别作用K562/AO_2细胞后,对ADM的IC50由(40.85±0.40)μg/ml分别降至(27.09±0.63)μg/ml、(4.29±0.13)μg/ml,部分逆转了K562/AO_2细胞对ADM的耐药性,其逆转倍数分别为1.51倍和9.52倍,两药物逆转程度比较,SCA作用较弱,差异具有极显著性(P0.01)。2 RT-PCR检测结果显示:K562/AO_2细胞高表达mdr1 mRNA,K562细胞不表达mdr1 mRNA,两株细胞mdr1 mRNA的表达水平具有极显著性差异(P0.01)。SCA及VRP分别作用K562/AO_2细胞24h、48h、72h,mdr1 mRNA的表达均随作用时间延长而逐渐降低,以72h表达最低,两药物比较无显著性差异(P0.05)。3 FCM检测结果显示:K562细胞膜表面不表达P-gp蛋白,K562/AO_2细胞膜表面P-gp蛋白表达量的相对值(FI)为5.82±0.08,两株细胞P-gp蛋白的表达具有极显著性差异(P0.01);SCA作用K562/AO_2细胞24h、48h、72h,P-gp蛋白表达量的FI值随作用时间延长而逐渐降低,72h P-gp表达最低为2.71±0.02;VRP作用相同时间后FI值降低更显著,72h P-gp表达降为1.16±0.03,两者均显著降低P-gp蛋白的表达,其中SCA降低P-gp蛋白表达程度不及VRP,差异具有极显著性(P0.01)。K562、K562/AO_2细胞均可检测到Bcl-2蛋白的表达,且在两株细胞中Bcl-2蛋白的表达无明显差异(P0.05);SCA及VRP分别作用K562细胞24h、48h、72h,Bcl-2表达量的FI值均随作用时间延长而逐渐降低,72h Bcl-2表达最低;同一时间点两药物比较,作用24h时,SCA降低Bcl-2蛋白表达能力较VRP强(P0.01),随作用时间的延长,两药物降低Bcl-2蛋白表达能力无明显差别(P0.05);SCA及VRP分别作用K562/AO_2细胞相同时间后,Bcl-2表达量的FI值随作用时间延长而逐渐降低,72h表达最低,分别为1.59±0.05、1.67±0.08;两药物均降低K562/AO_2细胞Bcl-2蛋白的表达,两者比较无明显差异(P0.05)。单独应用阿霉素处理K562/AO_2细胞,(选取30~120min)细胞内阿霉素浓度的相对值(mode)为(31.01±0.79)~(44.81±1.51),联合SCA和VRP分别处理细胞后,细胞内阿霉素的mode值随作用时间的延长而相应的增加,具有时间依赖性。其中SCA增加细胞内ADM的能力低于VRP,两者比较差异具有极显著性(P0.01)。 结论:1斑蝥酸钠在(0.05~10)μg/ml浓度范围内,能抑制K562细胞和K562/AO_2细胞的体外增殖,并呈浓度依赖性。2无毒剂量的斑蝥酸钠对K562/AO_2细胞阿霉素耐药性体外有一定的逆转作用,但较维拉帕米的逆转作用明显减弱。3可能的逆转机制:①一定浓度的斑蝥酸钠可能通过在mRNA转录水平和蛋白翻译水平抑制K562/AO_2细胞中mdr1 mRNA、P-gp的表达,降低K562/AO_2细胞的耐药性,逆转肿瘤细胞多药耐药。②一定浓度的斑蝥酸钠可能通过抑制P-gp药物泵的泵出功能,提高细胞内化疗药物的聚集,增加耐药细胞内化疗药物的浓度,从而有效杀伤肿瘤细胞达到逆转肿瘤细胞耐药。③一定浓度的斑蝥酸钠可能通过降低Bcl-2的表达,解除对Bax\Bak的抑制,可能也解除了对药物损伤死亡信号的抑制,从而促进细胞凋亡来逆转肿瘤细胞耐药。4本研究为临床应用提供了理论依据,为肿瘤多药耐药逆转提供了新的选择。


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