孕酮对大鼠脑弥漫性轴索损伤后脑中ZO-1表达的影响

【摘要】： 引言:脑弥漫性轴索损伤(Diffuse Axonal Injury, DAI)是一类常见的重型颅脑损伤,它是由剪应力造成脑白质形成以轴索肿胀、断裂为主要特征的多发性脑损伤,这种原发性脑损伤常继发血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)的严重破坏及通透性增加,造成弥漫性脑水肿,这是导致本病预后较差的主要原因。闭锁小带蛋白ZO-1(Zonula Occludens-1)是参与构成血脑屏障紧密连接的重要成分之一,ZO-1的结构和功能与血脑屏障紧密连接的其他成分密切相关,所以ZO-1的表达水平应该可以反映血脑屏障的状态。孕酮(Progesterone, PROG)是天然的孕激素,近年研究发现它可以在神经系统合成并发挥减轻脑水肿的作用,其机制可能是孕酮通过其还原产物5α-二氢孕酮(5α-dihydro progesterone, 5α-DHP)和3α,5α-四氢孕酮(3α,5α-allopregnanolone, 3α,5α-THP)发挥抗氧化作用以减少血脑屏障的破坏,但对ZO-1的表达是否存在一定的影响,目前国内外还没有这方面的报道。 目的:观察大鼠DAI后脑组织中的ZO-1表达水平的变化,以及血脑屏障对伊文思蓝(Evens Blue, EB)通透率的变化,探讨两者之间是否存在相关性。进一步观察DAI后给予孕酮治疗ZO-1表达水平的变化,探讨DAI后给予孕酮治疗对ZO-1的表达能否产生一定的影响。 方法:取健康成年雄性SD大鼠85只,体重350-375g(由河北医科大学实验动物中心提供)。按完全随机分组原则分为:假手术组(10只),DAI组(50只),孕酮治疗组(25只)。DAI组和孕酮治疗组分别按照6h、24h、48h、3d、7d的观察时限随机分为五个亚组。假手术组大鼠仅切开头皮,暴露颅骨及骨膜后直接缝合。DAI组和孕酮治疗组按照Marmarou氏方法制作DAI模型,打击高度为150cm,打击物重量为450g。孕酮治疗组于打击后迅速向大鼠腹腔注射孕酮(8mg/kg),以后每间隔12小时给药一次。随机从假手术组和DAI各亚组的10只动物中抽取5只大鼠,按Belayey法使用EB作为示踪剂检测血脑屏障的通透性。其余大鼠按规定观察时限麻醉后用4%多聚甲醛溶液快速灌注,断头剥离全脑,将全部标本浸入4%多聚甲醛溶液固定,并置于4℃冰箱保存备用。 通过对标本的HE染色在光镜下观察DAI后的特征性病理变化轴索回缩球(Axonal retraction ball, ARB)的出现。应用免疫组织化学染色SP法检测ZO-1在DAI组及孕酮治疗组标本中的表达。通过观察阳性反应物的平均积分光密度值(OD),对免疫组织化学染色阳性反应物进行分析。 应用SPSS13.0统计学软件,所得数据均以均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用两样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,当方差分析有显著性差异时,进一步用q检验作两两比较;以及根据实验要求作直线相关性分析。以P0.05作为判断差异有无统计学意义的标准。 结果:1光镜观察结果 DAI组和孕酮治疗组脑表面可见广泛的蛛网膜下腔出血,部分标本脑室内红细胞渗出,神经元胞核浓染、胞浆浅淡、胞体皱缩,神经元及小血管周围可见透明间隙,轴索迂曲肿胀变粗,出现典型的轴索回缩球。孕酮治疗组的病理变化较DAI组轻。 2血脑屏障对EB的通透率的变化 血脑屏障对EB的通透率在DAI 6h亚组开始上升,24h亚组仍继续升高,48h亚组达到高峰,之后逐渐降低,7d亚组仍高于假手术组水平。DAI组各亚组的通透率与假手术组比较,均有显著差异(p0.05)。 3假手术组ZO-1的表达 假手术组ZO-1着色于脑微细血管内皮细胞内膜和胞浆,呈阳性表达。 4 DAI组ZO-1表达水平的变化 DAI组ZO-1着色于脑微细血管内皮细胞内膜和胞浆,各亚组均有表达。ZO-1在假手术组的表达高于DAI组各亚组(p0.05)。ZO-1在DAI 6h亚组的表达开始下降,48h亚组降到最低,随后逐渐升高,7d亚组仍低于假手术组水平。ZO-1表达水平的变化与血脑屏障对EB通透率的变化呈明显负相关(r=-0.843, p0.01)。 5孕酮治疗组ZO-1表达水平的变化 孕酮治疗组ZO-1仍着色于脑微细血管内皮细胞内膜和胞浆,各亚组均有表达。ZO-1在孕酮治疗组6h亚组的表达与DAI组6h亚组比较,无明显差异(p0.05);在孕酮治疗组的24h、48h、3d和7d亚组的表达与DAI组相应的亚组比较,前者均高于后者(p0.05)。ZO-1在孕酮治疗组7d亚组的表达与假手术组比较无明显差异(p0.05);在孕酮治疗组的6h、24h、48h和3d亚组的表达与假手术组比较,均具有显著差异(p0.05)。 结论:1 DAI后血脑屏障对EB的通透率显著增加,48小时达到最高峰,表明DAI后血脑屏障遭到严重破坏。 2 DAI后血脑屏障的破坏伴随ZO-1表达水平的降低。 3 ZO-1在脑组织中表达水平的变化与血脑屏障对EB通透率的变化呈明显负相关,提示ZO-1表达水平的降低可以作为衡量血脑屏障破坏程度的标志。 4孕酮治疗组脑组织中的ZO-1表达水平高于DAI组,提示DAI后给予孕酮治疗抑制了ZO-1表达的下降,孕酮可能对血脑屏障起一定的保护作用。