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短帚霉的形态学观察及致病性的动物实验研究

汪贵娥  
【摘要】: 目的:短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)是一种腐生性条件致病真菌,通常引起甲真菌病,较少引起其他部位的感染,但目前国外已经有关于深部组织感染的报道。此菌分离于我科门诊病人,经中国医学科学院微生物研究所鉴定为Scopulariopsis brevicaulis。 本研究一方面通过对短帚霉形态学观察,进一步了解短帚霉的形态学特征与产孢方式,为临床上诊断短帚霉病提供指导;另一方面,通过动物实验检测其引起系统性感染的可能性,并且观察不同免疫状态下动物的死亡情况,同时对自然死亡和分期处死的小鼠进行解剖,通过镜检、组织逆培养、组织病理学检查、组织载菌量测定等方法比较各脏器的感染程度。为进一步了解此菌的致病力和引起的病理形态学改变提供实验室依据。 方法: 1 DNA序列分析提取分离菌DNA,PCR扩增其26SrDNA近5’端D1/D2区域,在DNA自动测序仪上进行直接双向测序确定碱基位点,通过GenBank/EMBL/DDBJ/PDB核酸序列数据库进行同源序列检索,通过系统树显示其亲缘关系。 2菌株的形态学观察 2.1大体菌落观察将我科保存菌株复温24h,转种于SDA培养基上, 37℃和27℃温箱培养,每天观察菌落的生长情况。 2.2光镜观察取其菌落标本置于载玻片上,10%KOH溶液溶解后,盖上盖玻片,光镜下观察。 2.3扫描电镜观察取两个温度下培养10天的菌落标本,置于4%的戊二醛中固定,常规制片后在扫描电镜下观察。 3动物的致病性试验 3.1短帚霉系统感染动物模型的制作将保存菌株复温,转种于SDA培养基上27℃培养10天。用无菌生理盐水制备成菌悬液,通过皮下、腹腔、静脉三种途径接种至不同免疫状态的小鼠。 3.2死亡率的观察连续观察各组小鼠感染该菌后四周内的自然死亡情况,记录死亡日期和死亡只数。 3.3感染内脏的大体观察将不同感染时间的动物解剖,分别取出心、肝、脾、肺、肾,观察各脏器是否肿大或萎缩、有无颜色变化等。 3.4直接镜检肉眼可见感染灶的脏器取脓灶处小块组织,压碎后于光学显微镜下直接镜检。 3.5组织逆培养各脏器用组织研磨器研碎后挑取少许分别接种于沙堡氏试管培养基,27℃温箱培养,观察菌落的生长情况,然后挑取菌落制成湿片在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态。 3.6组织病理学检查取各脏器表面肉眼可见病理改变组织,用10%福尔马林溶液常温固定,常规脱水、透明、包埋、切片,HE和PAS染色,光镜下观察组织病理学变化。 3.7肾脏载菌量(CFU)的测定单侧肾脏用组织研磨器研碎后,加无菌生理盐水1ml混匀,取10μl组织悬液均匀涂布于平皿培养基表面,27℃温箱中培养,48小时后读取平皿表面的菌落数。 结果: 1 DNA序列分析结果基于26SrDNA D1/D2区序列和Neighbor-Joining分析绘制的系统树,示该菌株与Scopulariopsis brevicaulis是近缘种的关系。 2大体菌落观察培养3~4天,菌落开始生长,初为白色膜样菌落,生长迅速,以后变为灰褐色。 3光镜下观察可见分枝分隔菌丝,帚状枝,分生孢子自环孢子梗长出一串,呈球形,壁厚,表面光滑或粗糙。 4扫描电镜观察可见帚状枝,菌丝末端或侧面着生球形的分生孢子。 5动物模型腹腔和静脉注射途径感染小鼠,真菌培养阳性,组织病理学检查可见大量菌丝和少数的孢子。皮下接种各脏器真菌培养和组织病理学改变均呈阴性。 6自然死亡情况免疫抑制静脉组在接种后第2天开始出现死亡,第3天达到死亡高峰,死亡率高到93.3%。免疫抑制腹腔组在接种该菌后3天开始出现死亡,第7天达到高峰,至2周止,死亡率为53.3%。其余各组均无自然死亡。 7内脏的大体改变见到肝脾肿大,或萎缩,呈紫红色。部分死亡小鼠的肺明显萎缩,呈粉色或白色。 8直接镜检可见大量分枝分隔菌丝,圆形孢子。 9组织逆培养三天后可见部分脏器长出菌落。 10病理学变化苏木精-伊红染色早期为急性炎细胞浸润,可见组织细胞坏死,后期可见组织细胞及多核细胞反应性增生。PAS染色可见紫红色的菌丝和圆形孢子。 11肾脏载菌量(CFU)无论免疫正常还是免疫抑制状态下,静脉注射组肾脏感染程度较腹腔组重,经统计学处理有显著性差异(P0.05);免疫抑制腹腔注射组肾脏感染程度较免疫力正常腹腔注射组重,经统计学处理有显著性差异(P0.05);免疫抑制静脉注射组肾脏感染程度较免疫力正常静脉注射组重,经统计学处理有显著性差异(P0.05)。 结论: 1短帚霉只有丝状型一种菌落形态,可见丰富的分枝分隔菌丝,有帚状枝,分生孢子由环孢子梗产生一串,呈球形,壁厚,表面光滑或粗糙有刺,为短帚霉的形态学特征。环痕产孢为其产孢方式。 2通过腹腔和静脉注射途径可以成功建立短帚霉系统性感染小鼠模型。皮下注射接种则不能致系统性感染。 3免疫力低下状态更易引起感染,感染的程度也更重。但当进入体内的菌量较大时也可引起免疫力正常的小鼠的系统性感染,说明此菌具有较强的致病力。 4短帚霉引起的组织病理学改变为真菌感染的急慢性炎症,并无特异性改变。 5死亡率和肾脏组织载菌量显示静脉接种引起的感染程度较腹腔接种更严重。


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