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青蒿琥酯、氧化苦参碱对L929肿瘤细胞免疫抑制作用影响及相关分子机制研究

刘欣燕  
【摘要】: 目的:肿瘤是当今严重威害人类生命健康的重大疾病,发病率和死亡率都很高。用药物治疗肿瘤,是肿瘤治疗的重要措施。中药是我国宝贵的医药资源,研究抗瘤中药是研究抗瘤药物的重要领域。研究不同中药制剂的不同抗瘤作用及其相关分子机制,是临床正确选择和使用这些抗瘤中药制剂的重要依据。肿瘤细胞来源于机体正常细胞的突变。机体免疫功能,特别是NK细胞和T细胞功能,在对肿瘤的免疫监视,防止肿瘤的发生发展中具有重要作用。肿瘤细胞分泌免疫抑制物质抑制机体免疫功能,即肿瘤细胞免疫抑制作用,特别是对NK细胞和T细胞功能的抑制,是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的重要机制,在促进肿瘤的发生发展中具有重要作用。因此,肿瘤的发生发展,不仅与机体的免疫功能,同时也与肿瘤细胞的免疫抑制作用密切相关。迄今已知可为肿瘤细胞分泌的免疫抑制分子约有20余种,其中报道较多且免疫抑制作用较强的有转化生长因子-β1(TGF-β1)、前列腺素E2(PGE2)、血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-10(IL-10)等。由于肿瘤细胞分泌的免疫抑制分子可在肿瘤局部形成深度免疫抑制“黑洞”区,不但身在其中的免疫细胞严重受抑,即使功能正常甚至活化的免疫细胞一旦进入,也将成为功能受抑的“沉默”细胞,结果使免疫细胞无能对其攻击清除,应是肿瘤逃避免疫监视得以发生发展的重要机制。显然,研究抗瘤中药制剂对肿瘤细胞免疫抑制作用影响及其相关分子机制具有重要意义。 本室前期研究发现,L929肿瘤细胞(小鼠成纤维母细胞瘤)培养上清有免疫抑制作用,提示其有免疫抑制分子分泌。青蒿琥酯和氧化苦参碱,是两个有一定抗瘤作用的市售中药制剂,但目前国内外尚无青蒿琥酯和氧化苦参碱对L929肿瘤细胞免疫抑制作用影响及相关分子机制的研究报道。为此,本研究拟在前期工作基础上,研究青蒿琥酯和氧化苦参碱对L929肿瘤细胞免疫抑制作用影响及相关分子机制,为进一步深入揭示这两种中药制剂的抗瘤机理,指导临床正确选择和合理使用,提供实验和理论依据。 方法:分别以含选定浓度青蒿琥酯(ART)或氧化苦参碱(MOX)的培液培养L929肿瘤细胞24h后,洗涤去除中药制剂,细胞再用不含中药制剂的培液连续作两次24h的再培养,分别留取第一次和第二次再培养的细胞和培养上清。其中,经ART作用后第一次再培养的细胞称为A-C1,第二次再培养的细胞称为A-C2,相应的上清分别称为A-S1和A-S2;经MOX作用后再培养的细胞分别称为O-C1和O-C2,上清分别称为O-S1和O-S2。以不含中药制剂培液作同步对照培养的细胞分别称为C-C1和C-C2,上清分别称为C-S1和C-S2。实验研究这些上清对小鼠脾细胞MTT法测定的NK杀伤和ConA诱导转化,以及直接免疫荧光FCM法分析的CD4+、CD8+、IL-2Rα、CD3ε+ζ+和CD3ε-ζ+表达共7项免疫功能指标的影响;定量ELISA法测定这些上清中TGF-β1、PGE2、VEGF和IL-10共4种免疫抑制分子的含量;以β-actin作内参照,RT-PCR法检测细胞中受影响最大的免疫抑制分子或其胞内合成限速酶的mRNA表达,表达强度以相对表达系数RC表示。将这些上清免疫抑制作用变化与相应上清中免疫抑制分子含量变化列表进行专业比对分析,以最大相似性推测两者的关系,然后作单因素相关统计分析,确定中药制剂影响L929肿瘤细胞对不同免疫功能指标免疫抑制作用的相关免疫抑制分子;将受影响最大的免疫抑制分子的上清中含量与其相应细胞内mRNA或其胞内合成限速酶mRNA表达强度进行单因素相关统计分析,明确中药制剂下调该分子分泌是发生在基因转录水平还是基因转录后水平。 结果: 1 L929单纯肿瘤细胞培养上清对小鼠脾细胞免疫功能指标的影响 在以培液代替L929单纯肿瘤细胞培养上清的正常对照(C-nS)组,小鼠脾细胞NK杀伤率、ConA诱导转化的A值和CD4+、CD8+、IL-2Rα、CD3ε+ζ+、CD3ε-ζ+表达细胞百分率分别为65.39±0.87%、0.925±0.026、48.24±2.10%、19.23±0.60%、26.50±0.85%、21.67±1.29%和16.33%±0.18%。与C-nS组相比,在以不含中药制剂培液作同步对照培养的L929单纯肿瘤细胞培养上清(C-S1、C-S2)组,均可使所检测的这7项免疫功能指标明显受抑:C-S1组分别为60.97±3.86%(P0.01)、0.440±0.038(P0.01)、22.72±2.61%(P0.01)、11.42±1.25%(P0.01)、10.39±0.49%(P0.001)、7.89±0.78%(P0.001)和10.93%±0.16%(P0.001),抑制率分别为8.34±4.55%、47.88%±1.89%、53.00±3.37%、40.71±4.65%、59.91%±0.77%、63.33±5.77%和33.05%±1.52% ; C-S2组分别为59.59±3.13%(P0.01)、0.441±0.047(P0.001)、21.89±2.18%(P0.01)、12.15±0.65%(P0.01)、9.76±0. 94%(P0.001)、7.45±0.54%(P0.001)和10.75%±0.59%(P0.001);抑制率分别为9.79±3.95%、48.00%±2.16%、54.69±2.55%、36.85±1.41%、61.49±0.85%、65.63±0.87%和33.32%±0.25%;而C-S1组与C-S2组无统计学差异(均P0.05)。 2青蒿琥酯或氧化苦参碱作用后L929再培养上清对小鼠脾细胞免疫功能指标的影响 经青蒿琥酯作用后的L929肿瘤细胞:⑴其第一次再培养上清(A-S1)与相应对照上清(C-S1)相比,除对CD8+表达的抑制作用无明显改变(P0.05)外,对其余6项免疫功能指标的抑制作用均明显降低(分别为P0.001,P0.01,P0.05,P0.05,P0.001,P0.01);⑵其第二次再培养上清(A-S2)与A-S1相比:①对CD8+表达的抑制作用明显上升(P0.05);②对CD3ε+ζ+表达的抑制作用明显回升(P0.01),但未至相应对照C-S2水平(P0.01);③对NK杀伤、ConA诱导转化和CD4+、IL-2Rα和CD3ε-ζ+表达的抑制均无显著变化(均P0.05)。经氧化苦参碱作用后的L929肿瘤细胞:①其第一次再培养上清(O-S1)与相应对照上清(C-S1)相比,除对CD8+表达的免疫抑制作用无明显变化(P0.05)外,对其余6项免疫功能指标的免疫抑制作用均明显降低(分别为P0.05,P0.01,P0.05,P0.05,P0.001,P0.01);②其第二次再培养上清(O-S2)与O-S1相比,除对CD3ε+ζ+表达的抑制作用明显回升外(P0.05;但未至相应对照上清C-S2水平,P0.01),对其余6项免疫功能指标(NK杀伤、ConA诱导转化和CD4+、CD8+、IL-2Rα和CD3ε-ζ+表达)的抑制作用均无显著变化(均P0.05)。 3青蒿琥酯或氧化苦参碱对L929肿瘤细胞4种免疫抑制分子分泌的影响 未经中药制剂作用的L929肿瘤细胞可稳定分泌所测的4种免疫抑制分子(C-S1与C-S2相比,P0.05),以TGF-β1及PGE2含量最高,分别为(198.15±3.23)pg/ml和(133.76±5.16)pg/ml,VEGF和IL-10含量较低,分别为(33.38±0.59)pg/ml和(27.31±0.37)pg/ml。 经青蒿琥酯作用后的L929肿瘤细胞:①其第一次再培养上清(A-S1)与相应对照上清(C-S1)相比:4种免疫抑制分子的浓度均明显降低,分别为(99.05±8.02)pg/ml(P0.001,降低50.01%)、(66.57±4.71)pg/ml(P0.001,降低50.23%)、(21.03±0.87)pg/ml(P0.01,降低36.99%)和(22.89±0.57)pg/ml(P0.01,降低16.18%);②其第二次再培养上清(A-S2)与A-S1相比,除IL-10含量明显上升(P0.05)外,其余3种分子含量无显著变化(均P0.05)。 经氧化苦参碱作用后的L929肿瘤细胞:①其第一次再培养上清(O-S1)与对照上清(C-S1)相比:4种免疫抑制分子的含量均明显降低(均P0.01),分别为TGF-β1(91.35±9.62)pg/m(l降低53.89%),PGE2,(69.43±2.32)pg/ml(降低48.23%),VEGF(21.36±0.75)pg/ml (降低36.01%)和IL-10(22.84±0.33)pg/ml(降低16.37%)。②其第二次再培养上清(O-S2)与O-S1相比,4种免疫抑制分子含量均无显著变化(均P0.05)。 4青蒿琥酯和氧化苦参碱影响L929肿瘤细胞免疫抑制作用的相关分子分析 专业和统计分析表明:①青蒿琥酯和氧化苦参碱下调L929肿瘤细胞对小鼠脾细胞ConA诱导转化及CD4+、IL-2Rα和CD3ε-ζ+表达的免疫抑制作用的相关分子是TGF-β1和PGE2 ;②青蒿琥酯下调L929肿瘤细胞对小鼠脾细胞NK杀伤的免疫抑制作用的相关分子是TGF-β1和PGE2;③氧化苦参碱下调L929肿瘤细胞对小鼠脾细胞NK杀伤的免疫抑制作用的相关分子是TGF-β1。 5青蒿琥酯和氧化苦参碱对L929肿瘤细胞TGF-β1 mRNA和COX-2mRNA表达的影响 在所测的L929肿瘤细胞分泌的4种免疫抑制分子中,受青蒿琥酯和氧化苦参碱影响最大的是TGF-β1和PGE2,而COX-2是PGE2的胞内合成限速酶,故测定TGF-β1 mRNA和COX-2 mRNA表达,可以揭示这两种中药制剂下调这两种免疫抑制分子分泌是发生在基因转录水平还是基因转录后水平。结果显示,未受中药制剂作用的L929肿瘤细胞可稳定高表达TGF-β1 mRNA和COX-2 mRNA(C-C1与C-C2相比,均P0.05);中药制剂作用后再培养的L929肿瘤细胞(A-C1和A-C2、O-C1和O-C2)的TGF-β1 mRNA和COX-2 mRNA表达水平均显著降低(分别为:TGF-β1mRNA,P0.001;COX-2 mRNA,P0.005),其mRNA表达水平与上清中相应免疫抑制分子TGF-β1和PGE2含量之间呈显著正相关关系(分别为ART:r =1.000, P=0.000; r =0.992, P=0.008; MOX:r =0.997, P=0.003; r =0.995, P=0.005),表明两种中药制剂下调L929肿瘤细胞TGF-β1和PGE2的分泌是发生在基因转录水平。 结论: 1不经ART或MOX作用的L929肿瘤细胞,其培养上清可显著抑制所测小鼠脾细胞7项免疫功能指标(ConA诱导转化、NK杀伤及CD4+、CD8+、IL-2Rα、CD3ε+ζ+和CD3ε-ζ+表达);经ART或MOX作用后再培养的L929肿瘤细胞,其培养上清对这7项免疫功能指标的抑制作用显著降低。 2不经ART或MOX作用的L929肿瘤细胞能稳定分泌所测4种免疫抑制分子(TGF-β1、PGE2、VEGF和IL-10);ART或MOX均能显著下调L929肿瘤细胞这4种免疫抑制分子分泌。 3 ART下调L929肿瘤细胞对小鼠脾细胞ConA诱导转化、NK杀伤和IL-2Rα、CD4+及CD3ε-ζ+表达的免疫抑制作用的相关分子是TGF-β1和PGE2。 4 MOX下调L929肿瘤细胞对小鼠脾细胞ConA诱导转化和IL-2Rα、CD4+及CD3ε-ζ+表达的免疫抑制作用的相关分子是TGF-β1和PGE2;下调L929肿瘤细胞对小鼠脾细胞NK杀伤的免疫抑制作用的相关分子是TGF-β1。 5 ART和MOX下调L929肿瘤细胞TGF-β1和PGE2分泌与降低L929肿瘤细胞TGF-β1 mRNA和COX-2 mRNA表达相关。


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