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外照射联合靶向治疗的实验研究

张明  
【摘要】: 癌症仍是目前威胁人类生命健康的重要疾病之一。放射治疗(Radiotherapy)是传统且有效的治疗手段之一。近年放疗技术不断改进,开展了三维适形放疗、调强放疗、图像引导放疗和Tomotherapy等,这些技术都提高了放射治疗的有效率。但是因肿瘤类型、分期、靶区内正常组织的剂量限制、微转移灶、放疗后产生乏氧和抵抗等因素一定程度上限制了其疗效。 随着分子生物学和基因工程的发展,人们在不断探索癌症分子生物学发病机制的同时,意识到如果能够针对癌症的特异性变化进行治疗,将会大大改善治疗效果。因此靶向治疗应运而生。它以肿瘤细胞的特异性改变为作用靶点,是一种有的放矢的治疗方法。 放射免疫治疗(radioimmunotherapy)是靶向治疗的一种。它集免疫学、放射生物学、肿瘤放射治疗学、肿瘤内科学和核医学为一身的肿瘤治疗方式。其利用靶向抗体携带的核素发出的射线持续照射肿瘤细胞,因此对肿瘤微转移灶及乏氧、射线抵抗细胞有一定的优势。虽然其在血液系统肿瘤的治疗中取得了令人鼓舞的结果,但是单独治疗实体瘤时,靶区剂量远远达不到治疗剂量,因而限制了其在实体瘤中的应用。 溶瘤病毒治疗(Oncolytic virotherapy)是利用基因工程改造的病毒在特异的肿瘤细胞中复制并溶解细胞,释放出来的子代病毒继续感染周围的肿瘤细胞周而复始杀灭肿瘤。虽然单一病毒治疗在体外实验中有效,但是临床疗效并不令人满意。但有资料表明,联合放化疗后可增加治疗效果。合理、有计划的综合治疗可以充分利用和发挥各种治疗手段的优缺点。因此本实验拟通过体内/外实验研究放免新药碘[~(131)I]标记的肿瘤细胞核人鼠嵌合单抗(~(131)I-chTNT)和条件复制溶瘤病毒Ad-MK联合放疗后对肿瘤的影响,希望能够为临床的合理应用提供有益的借鉴。 第一部分外照射联合碘[~(131)I]标记的肿瘤细胞核人鼠嵌合单抗对C57BL/6小鼠Lewis瘤影响的实验研究 目的:研究外照射联合不同途径注射碘[~(131)I]标记的肿瘤细胞核人鼠嵌合单抗(~(131)I-chTNT)对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响并观察~(131)I-chTNT在小鼠体内的分布和显像。 方法:建立C57BL/6近交系小鼠Lewis瘤模型,当接种于右后肢的肿瘤直径达指定大小时随机分组进行实验。体内分布和活体显像实验分为两组:①单药组:静脉或瘤内给药;②联合组:外照射15Gy 24小时后再以不同途径给药。分别于给药后不同时间测量肿瘤组织及感兴趣器官的放射性,并观察活体显像情况。荷瘤小鼠肿瘤生长效应实验分为四组:①空白对照组;②单药组:静脉或瘤内给药;③照射组:外照射15Gy;④联合组:外照射15Gy 24小时后再以不同途径给药。观察指标为肿瘤生长延迟时间。 结果:(1)外照射联合尾静脉注射~(131)I-chTNT荷瘤小鼠体内分布实验中单药组和联合组肿瘤组织的放射性在给药24小时最高,联合组高于单药组,两组间差异有统计学意义(P=0.018),直至72小时、120小时联合组肿瘤组织放射性仍高于单药组, P值分别为0.041、0.024。两组中正常组织的放射性差异无统计学意义(P0.05)。活体核素显像中两组均在给药3天时肿瘤区放射性浓聚最集中,持续至7天仍可见肿瘤影像。联合组肿瘤区比单药组的浓聚强且持续时间长。荷瘤小鼠肿瘤生长效应实验表明:单药组、外照射组、联合组的绝对延迟时间分别为(3.1±1.75)天、(9.1±1.86)天和(13.1±2.6)天,标准化延迟时间为10天,~(131)I-chTNT对放射的增益因子为1.08。 (2)外照射联合瘤内注射碘~(131)I-chTNT的荷瘤小鼠体内分布实验中单药组和联合组肿瘤组织的放射性均在给药24小时最高,联合组高于单药组,两组间差异有统计学意义(P=0.023),直至72小时联合组肿瘤组织放射性仍高于单药组(P=0.038)。两组中正常组织的放射性差异无统计学意义(P0.05)。活体核素显像中两组均在给药1天时肿瘤区浓聚最高,至7天仍可见肿瘤影像。联合组比单药组肿瘤区放射性浓聚强而且持续时间长。荷瘤小鼠肿瘤生长效应实验表明:单药组、外照射组、联合组的的绝对延迟时间分别为(3.3±1.75)天、(6.0±2.02)天和(9.5±1.93)天,标准化延迟时间为6.2天,~(131)I-chTNT对放射的增益因子为1.03。 结论:外照射联合静脉和瘤内注射~(131)I-chTNT后可促进~(131)I-chTNT在荷瘤小鼠体内肿瘤区的浓聚,但不增加对正常组织的影响。二者联合应用时~(131)I-chTNT可提高外照射对荷瘤小鼠的放射效应。 第二部分外照射及丝裂霉素联合复制型溶瘤腺病毒Ad-MK对膀胱癌细胞的作用 目的:以Midkine(MK)基因作为特异启动子的条件复制溶瘤腺病毒Ad-MK可在MK mRNA高表达的肿瘤细胞中特异性的复制而杀灭肿瘤。本实验拟探讨膀胱癌细胞中MK mRNA的表达,进而研究Ad-MK对膀胱癌细胞增殖的影响以及联合放疗、丝裂霉素后对细胞的作用,为临床膀胱癌综合治疗提供细胞学基础。 方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测浅表型和恶性浸润性膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87、EJ中MK mRNA的表达及Ad-MK感染细胞后,细胞中腺病毒E1a mRNA的表达。采用倒置显微镜观察条件复制型溶瘤腺病毒Ad-MK作用于膀胱癌细胞后细胞形态学的改变。采用MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法检测Ad-MK联合丝裂霉素后对膀胱癌细胞BIU-87的作用,通过计算相互作用指数CDI数值观察两者联合是否有协同作用。细胞存活率检测Ad-MK对膀胱癌细胞BIU-87放射敏感性的影响。通过病毒复制量的测定观察外照射及丝裂霉素对溶瘤腺病毒Ad-MK在膀胱癌细胞BIU-87中复制的影响。 结果:浅表型和恶性浸润性膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87、EJ中均可见MK mRNA的表达。条件复制型溶瘤腺病毒Ad-MK作用于BIU-87细胞后,引起细胞形态学的改变。细胞变圆,膨胀,悬浮,胞浆中出现空泡。之后细胞裂解。其形态学改变有时间性变化。最后细胞数量逐渐减少。Ad-MK感染BIU-87细胞后,RT-PCR可检测到细胞中E1a mRNA的表达。Ad-MK对BIU-87细胞的增殖抑制作用呈明显的量效、时效关系。随着浓度的增加及时间的延长对细胞的抑制作用逐渐增加。与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。Ad-MK联合低剂量丝裂霉素(50μg/L)后对BIU-87细胞生长的抑制作用明显增加,与单用Ad-MK或MMC组比较,差异有统计学意义(P0.01)。数据分析显示CDI1,则表示两者联合使用对BIU-87细胞有协同作用。4Gy照射BIU-87细胞的存活率为0.11±0.013, 0.1MOI Ad-MK处理BIU-87细胞的存活率为0.13±0.004,4Gy联合0.1MOI Ad-MK后细胞存活率为0.003±0.002。联合组细胞的存活率与单用Ad-MK或放疗相比,差异有统计学意义(P0.01)。通过对病毒复制量的测定发现低剂量放疗和MMC联合病毒治疗后,并未减少病毒在细胞中的复制:单用0.1MOI Ad-MK感染BIU-87细胞,4天后可产生3.3×103PFU/cell。联合放疗和MMC后4天测得的病毒量分别为4.4×103PFU/cell和4.1×103PFU/cell。与单独病毒感染组相比,组间差异具有统计学意义(P0.05)。 结论:浅表型和恶性浸润性膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87、EJ两种细胞系中均有MK mRNA的表达;采用RT-PCR技术可检测到受病毒感染的细胞中有病毒E1a mRNA的表达,说明Ad-MK在膀胱癌细胞中进行了复制。这个结果也提示,在形态学观察和MTT实验中观察到的Ad-MK对膀胱癌细胞的杀伤作用是由于病毒在细胞中选择性复制引起的。条件复制型溶瘤腺病毒Ad-MK对膀胱癌细胞BIU-87细胞的增殖抑制作用呈量效和时效关系。放疗和丝裂霉素能增强Ad-MK的细胞毒作用,并能增加病毒在细胞中的复制。 第三部分膀胱移行细胞癌中MK蛋白表达与其对应的临床病理特征及预后的关系 目的:研究中期因子(midkine,MK)在膀胱移行细胞癌组织中的表达,探讨其与膀胱癌对应的临床病理特征及与术后患者预后的关系,探讨该因子成为膀胱癌分子标志物、预后分析指标及靶向治疗靶点的可能性。 方法:采用SP免疫组化染色法检测50例手术切除的人膀胱移行细胞癌组织和10例正常膀胱粘膜中MK蛋白的表达,分析MK蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的表达与其临床对应的各项病理参数的关系,对其中40例有随访资料者的MK蛋白表达与预后的关系进行统计学分析。 结果: MK蛋白主要定位于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜中。在人膀胱移行细胞癌组织中MK蛋白的表达率为90%(45/50),在正常膀胱组织中无表达或弱表达;膀胱移行细胞癌中随肿瘤浸润深度和分级的增加,MK蛋白的表达逐步增强(P值分别为0.043、0.003)。而MK蛋白表达与性别、肿瘤大小、数目、初复治无相关(P值分别为0.466、0.229、0.837、0.785)。生存分析表明MK蛋白低表达组1、3、5年生存率分别81.8%、81.8%、72.7%,MK蛋白高表达组1、3、5年生存率分别63.6%、36.4%、18.2%,MK蛋白低表达组生存率显著低于高表达组,两组间生存率的差异具有统计学意义(P0.05)。 结论: MK蛋白在人膀胱移行细胞癌组织中高表达,在正常膀胱粘膜上皮无或弱表达。MK蛋白表达随肿瘤分期和分级的增加表达逐步增强,而与患者性别、年龄、肿瘤大小、数目、初复治无相关。MK蛋白表达与膀胱移行细胞癌术后患者的预后相关,MK蛋白呈高表达者的生存时间比低表达者短。因此MK有可能成为膀胱移行细胞癌有价值的分子标志物、预后分析指标及靶向治疗的靶点。 结论 1.外照射联合静脉和瘤内注射~(131)I-chTNT后可促进~(131)I-chTNT在荷瘤小鼠体内肿瘤区的浓聚,但不增加对正常组织的影响。二者联合应用时~(131)I-chTNT可提高外照射对荷瘤小鼠的放射效应。 2.浅表型和恶性浸润性膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87、EJ两种细胞系中均有MK mRNA的表达;条件复制型溶瘤腺病毒Ad-MK可在膀胱癌细胞中BIU-87复制。Ad-MK对膀胱癌细胞BIU-87细胞的增殖抑制作用呈量效和时效关系。放疗和丝裂霉素能增强Ad-MK的细胞毒作用,并能增加病毒在细胞中的复制。 3. MK蛋白在膀胱移行细胞癌组织中高表达,在正常膀胱粘膜上皮无或弱表达。其表达随肿瘤分期和分级的增加逐步增强,而与患者性别、年龄、肿瘤大小、数目、初复治无相关。MK表达与膀胱癌术后患者的预后相关,MK蛋白高表达者的生存时间比低表达者短。因此MK有可能成为膀胱移行细胞癌有价值的分子标志物、预后分析指标及靶向治疗的靶点。


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