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DNA甲基化对TIG2基因在人白血病细胞中表达的影响

崔桂荣  
【摘要】: 目的:越来越多的研究表明DNA甲基化状态异常尤其是抑癌基因的高甲基化失表达在白血病的发生发展、白血病的诊断、检测微小残留病变(minimal residual disease,MRD)、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用。近年来DNA甲基化谱研究的进展以及尝试利用去甲基化药物辅助治疗白血病也越来越引人注目。 维甲酸类似物Tazarotene(他扎罗汀)是一种治疗皮肤病的药物。Tazarotene可上调TIG1(tazarotene-induced gene-1)、TIG2和TIG3的表达。在正常人皮肤中,TIG2基因是高水平表达的,而在牛皮癣患者皮肤中表达沉默或低水平表达。对TIG2的研究发现,TIG2是孤儿G蛋白偶联受体(orphan G protein-coupled receptor,GPCR)ChemR23的天然配体,在体外具有特异趋化未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,iDC)和巨噬细胞(macrophage, Mφ)的特性;另外,有研究发现,来自血清和炎症相关的蛋白酶,可切割TIG2前体的-COOH端,使TIG2活化,在ChemR23介导下发挥趋化活性。TIG2广泛表达在人体正常组织中,但在肿瘤中,TIG2基因的表达和功能研究目前国内外报道尚不多见。有学者应用抑制消减杂交技术(suppressive subtractive hybridization,SSH)筛选肺癌组织及其癌旁正常组织差异表达的基因,结果发现TIG2基因在正常肺细胞中表达,而在肺癌细胞中表达沉默,提示TIG2基因可能在肺癌的发生、发展中起作用。但TIG2表达沉默的分子机制及其在血液肿瘤中的表达状态还未见报道。 本研究是在前期研究的基础上,检测TIG2基因在白血病细胞和正常骨髓细胞中的表达,然后在白血病细胞中加入去甲基化试剂5-杂氮胞苷(5-Aza-CdR),检测TIG2基因表达的变化。应用Cp G岛预测软件分析TIG2基因启动子和第一外显子区域Cp G岛的分布、用甲基化特异PCR方法检测TIG2基因甲基化情况。初步阐释TIG2基因在白血病细胞中表达沉默的分子机制,为研究TIG2基因在白血病发病中的生物学功能奠定基础,为临床白血病的诊断、分型、治疗及预后提供理论依据。 方法: 1细胞培养 复苏白血病细胞株(K562、U937、KG1),加入RPMI1640重新悬浮,转移到培养瓶中,在含5.0% CO2培养箱中,37℃培养,观察。 2临床标本的收集和保存 抽取62例白血病患者(经骨髓细胞形态学、细胞化学、免疫表型、细胞遗传学、分子生物学等检查确诊)的骨髓液及正常对照标本,提取单个核细胞,保存在-80℃冰箱中。 3 TIG2基因在白血病细胞株、原代白血病细胞和正常骨髓细胞中的表达 从保存的白血病细胞株、原代白血病细胞和正常骨髓细胞的单个核细胞中分别提取RNA,荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)检测TIG2 mRNA的表达。 4 TIG2基因启动子区域Cp G岛预测 应用Cp G岛预测软件MethPrimer(http;//www.urogene. rg/methprimer)对TIG2基因的启动子和第一外显子区域分析,同时设计甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)。 5去甲基化试剂5-杂氮胞苷对TIG2基因表达影响 白血病细胞株K562、KG1、U937经不同浓度的去甲基化试剂5-Aza-CdR处理后,应用Real-Time Quantitative PCR检测TIG2 mRNA的表达。 6检测白血病及正常对照标本中TIG2基因Cp G岛甲基化状态 提取白血病及正常对照标本单个核细胞的基因组DNA,经亚硫酸盐转化、纯化,然后分别用甲基化引物和非甲基化引物扩增,通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测白血病及正常对照标本中TIG2基因Cp G岛甲基化的发生率。 结果: 1 TIG2基因在白血病细胞和正常骨髓细胞中的表达 经Real-Time Quantitative PCR检测,发现TIG2 mRNA在正常骨髓细胞中高表达,而在白血病细胞株和原代白血病细胞中低表达或沉默(以β-actin作为内参照)。 2去甲基化试剂5-Aza-CdR对TIG2基因表达的影响 用不同浓度的5-Aza-CdR处理慢性粒细胞白血病急变期细胞株K562、急性单核细胞白血病细胞株U937、较原始细胞白血病细胞株KG1后,用Real-Time Quantitative PCR方法检测TIG2基因的表达,结果显示,5-Aza-CdR处理后TIG2基因表达增强,并且随着5-Aza-CdR浓度的增高,TIG2 mRNA的表达水平也增高。 3 TIG2基因启动子区域Cp G岛预测 经Cp G岛预测软件MethPrimer对TIG2基因启动子和第一外显子区域的分析,发现此区域存在典型的Cp G岛。 4检测TIG2基因Cp G岛甲基化状态 应用甲基化特异PCR检测白血病细胞株,原代白血病细胞及正常对照标本中TIG2基因的甲基化状态,结果显示,白血病细胞株均发生甲基化,原代白血病细胞常常发生甲基化(包括35/42例新诊断白血病和7/20例持续缓解白血病),而在正常标本中不发生甲基化。 结论:TIG2基因在白血病细胞中表达减低或沉默,而在正常骨髓细胞中呈高表达;经去甲基化试剂作用后,TIG2基因在白血病细胞中恢复表达;经甲基化特异PCR(methylation-sepecific PCR, MSP)检测,显示TIG2基因启动子区域Cp G岛发生甲基化。提示甲基化可能是导致TIG2基因转录沉默的重要机制之一。


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