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miniSTR复合扩增体系的研制与开发

白雪  
【摘要】: 目的:在法医DNA检验中,STR技术已经广泛用于个人识别和亲权鉴定方面。但是法医检案工作中,常常由于高温、潮湿、暴晒、微生物等因素的影响,使检材中的DNA分子被损坏,发生断裂,分子变小,大片段丢失。在这些情况下应用STR技术不能成功地得出结论,经常会出现“优势扩增”或者“无效扩增”,这就给正确的DNA分型带来困难。重新设计引物,减小扩增产物片段长度是目前解决DNA高度降解检材检验问题的一种新的方法。2001年9·11恐怖事件时这种方法被应用于遇难者的尸源认定,同时被正式命名为miniSTR技术。目前,AB公司已经开发出针对CODIS系统以内8个基因座的miniSTR商品化试剂盒。但由于CODIS系统内一些基因座侧翼序列不适合设计新的引物,或者等位基因范围太大,使这些基因座的扩增片段长度难以缩短到理想长度(125bp),因而并非CODIS系统内所有的STR基因座都适用于设计成miniSTR基因座。为解决这个问题,增加系统效能,非常有必要寻找CODIS系统之外的更多的miniSTR基因座,并进行人群调查。因此,本实验的目的是在数据库中筛选出适合中国汉族人群特征的miniSTR基因座,然后将其构建成新的miniSTR荧光标记复合扩增体系;并按照美国DNA分析方法技术工作组(TWGDAM)的指导方案,对复合扩增系统的灵敏度,基因座的种属特异性,案例应用,降解模型,陈旧样本等法医学应用进行初步研究。最终构建成符合中国汉族人群特征的miniSTR复合扩增体系,从而推动法医DNA试剂盒的国产化进程。 方法:①参考Coble等的引物,在中国河北汉族120名无关个体中进行26个miniSTR基因座PCR扩增,获得河北汉族群体遗传学数据,根据数据初步筛选出8个多态性较高、片段较短的miniSTR基因座;在中国其他地区754个无关个体中进行这8个miniSTR基因座PCR扩增,扩增产物使用聚丙烯酞胺凝胶电泳分离,银染法显色,获得8个基因座的群体遗传学数据和各基因座的常见等位基因。②采用国产DNA聚合酶构建这8个miniSTR基因座的复合扩增体系,利用荧光复合扩增技术扩增,ABI310/3130基因分析仪对产物进行检测,Genemapper3.2软件分析结果;根据不同引物浓度、Mg~(2+)浓度、不同退火温度、不同循环次数下复合扩增的效果对复合体系进行优化。③根据群体遗传学研究的结果,应用分子克隆技术构建各基因座等位基因标准分型物,并根据国际法医遗传学会(international society of forensic genetics, ISFG )推荐的命名原则对各等位基因进行命名,同时根据检测数据进行统计分析编制出miniSTR复合扩增体系的基因分型模版。④对该荧光标记复合扩增体系的灵敏度、种属特异性、可重复性及对陈旧、腐败降解检材DNA的检测能力进行了研究;用实际案例进行验证,并与商品化试剂盒进行比较。 结果:①成功构建了两个荧光标记miniSTR复合扩增体系,其中复合体系1包含D10S1248, D2S441, D1S1677和D9S2157四个基因座,复合体系2包含D9S1122, D10S1435, D12ATA63, D2S1776和Amelogenin五个基因座。应用该体系对300份中国汉族无关个体样本进行检验分析,经群体遗传学计算,该系统的累积个人识别率和非父排除率分别为0.99999999228和0.98547130732。②本实验构建的两个复合扩增体系条件易于优化,采用国产Taq酶进行扩增,即可得到满意的扩增产物和分型结果。相对于国外昂贵的试剂盒,它是一种成本低廉但效率高的miniSTR基因座复合扩增体系。③应用分子克隆技术,对9个基因座的64个等位基因进行克隆,经过调整各基因座等位基因的含量,构建出了两组复合体系的等位基因标准对照体系。根据实验数据和测序的命名结果设置基因分析命名参数指标,建立了两个荧光标记miniSTR复合扩增体系的基因分型命名模版,可以对样本准确分型。④法医应用性研究证明该体系具有良好的种属特异性,除恒河猴在Amelogenin出现色谱峰外,其余8个基因座在8种常见动物中均无特异性产物峰出现;对同一个体的不同组织检测结果一致;在0.125ngDNA模板量的情况下,可对9个基因座进行正确分型;通过对陈旧样本和降解模型的研究证明,该体系对降解检材有良好的扩增效果,较常规大片段STR试剂盒扩增成功率高,可用于常规试剂盒扩增失败的降解样本的分型;通过8个实际案例证明,该体系能用于法医学实践中,结果与鉴定结论一致。 结论:本实验成功的构建了适合中国汉族人群的两个荧光标记miniSTR复合扩增体系。该荧光标记复合扩增体系可应用于ABI 310/3130检测平台,该体系扩增条件易于优化,成本低廉,分型结果稳定,种属特异性好,灵敏度和准确度高,对降解检材扩增成功率高,可以应用于法医学实际检案中,特别适合对陈旧检材和降解检材的DNA检测。为国内法医DNA分析提供了一个成本低,性能好的荧光标记miniSTR复合扩增检验系统,具有重大的应用价值。


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