慢性间歇性低压低氧对豚鼠心脏的保护作用及其机制研究

【摘要】： 间歇性低氧是指一定时间暴露于低氧环境,而其余时间处于常氧环境。间歇性低氧是机体某种生理和病理状态下的低氧形式。研究表明:慢性间歇性低压低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH),类似缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC),具有明显的心脏保护作用,表现为增强心肌对缺血/再灌注损伤的耐受性、限制心肌梗死面积和形态学改变、抗细胞凋亡、促进缺血/再灌注心脏舒缩功能的恢复,以及抗心律失常。尽管CIHH对心脏的保护作用不容质疑,但其作用机制远未阐明。众所周知,氧自由基是缺血/再灌注和低氧/复氧诱发的心肌细胞膜损伤的一个重要原因。内源性抗氧化系统在CIHH心肌保护中的作用报道不一致。抗氧化是否参与了CIHH的心肌保护作用需要更进一步的研究。 Na+,K+-ATP酶即钠钾泵是存在于细胞膜上的膜蛋白,主要由α亚基和β亚基组成,其功能主要是维持细胞内外钠钾离子的浓度梯度。当心肌缺血时,导致细胞内钠离子浓度升高,细胞内钙离子浓度增加造成钙超载,钙超载是心肌缺血引起损伤的重要因素之一。钠钾泵可以排出细胞内多余的钠离子,从而使细胞内钠离子降低,使钠钙交换体的功能增强排出细胞内多余的钙离子。有研究报道,心肌缺血或缺血/再灌注会抑制钠钾泵的活性。CIHH可减弱心肌缺血时钙离子的增加,这可能有钠钾泵的参与。是否CIHH对钠钾泵有影响尚无研究。有研究表明,活性氧簇(ROS)与钠钾泵关系密切,可显著抑制钠钾泵。在心肌缺血或缺血/再灌注时会有ROS的大量生成,这可能是心肌缺血或缺血/再灌注引起钠钾泵抑制的原因之一。 本实验应用离体心脏灌流技术、细胞动缘系统、全细胞膜片钳技术及分子生物学方法,探讨了CIHH对豚鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用及抗氧化酶和Na,K-ATPase在CIHH对豚鼠心脏保护中所起的作用。研究分为三部分(1)CIHH对豚鼠缺血/再灌注心脏的保护作用:利用Langendorff离体心脏灌注系统,建立离体豚鼠心脏缺血/再灌注模型,观察CIHH对豚鼠心脏缺血/再灌注损伤的影响。(2)抗氧化酶在CIHH心脏保护中的作用:在豚鼠离体灌流心脏,通过药理学及分子生物学方法探讨抗氧化酶在CIHH心脏保护中的作用。(3)钠钾泵在CIHH心脏保护中的作用:利用细胞动缘及膜片钳技术观察CIHH对钠钾泵的作用及钠钾泵在CIHH心脏保护中的作用。 第一部分CIHH对豚鼠心肌缺血再灌损伤的保护作用 目的:观察CIHH对豚鼠心肌缺血再灌损伤是否有保护作用。 方法:132只雄性成年豚鼠(250±20g)随机分为两组:非间歇性低氧组(non-CIHH)与间歇性低氧组(CIHH)。其中CIHH又分为CIHH处理14天组(CIHH14)、CIHH处理28天组(CIHH28)和CIHH处理42天组(CIHH42),而non-CIHH又相应分为non-CIHH14、non-CIHH28和non-CIHH42。CIHH处理组动物于低压氧舱分别接受14,28天、42天模拟5000米海拔高度(PB=404 mmHg, PO2=84 mmHg)的低压低氧处理,每天6小时。non-CIHH组动物除了不接受低氧处理外,其它处理均与CIHH组动物相同。离体心脏利用Langendorff灌流给予缺血(30min)/再灌注(60min)处理,观察心脏功能的变化。TTC染色方法测定心肌梗死面积。 结果: 1 CIHH14, 28, 42组豚鼠的体重(BW),全心/体重(THW/BW)、右心室/左心室重量(RVW/LVW、右心室/体重(RVW/BW)与相应non-CIHH组无显著差异。 2基础状态下,除CIHH28和CIHH42组的CF较相应non-CIHH组增加外,其余心功能与non-CIHH组动物均无显著性差异。心脏停灌缺血30 min后再灌注60min, CIHH28和CIHH 42组的心功能参数,如LVDP,LVEDP,±dp/dtmax恢复都较相应non-CIHH组明显好转。 3 CIHH28和CIHH 42天能明显降低缺血/再灌注后心肌梗死面积。 小结:CIHH28和CIHH 42天增强成年豚鼠心脏对缺血/再灌注损伤的抵抗能力。 第二部分抗氧化酶在CIHH心脏保护中的作用 目的:探讨抗氧化酶在CIHH心脏保护中的作用。 方法:142只雄性成年豚鼠(250±20g)随机分为两组:非间歇性低氧组(non-CIHH)与间歇性低氧组(CIHH)。CIHH处理组动物于低压氧舱分别接受28天、5000米海拔高度(PB=404 mmHg, PO2=84 mmHg)的低压低氧处理,每天6小时。non-CIHH组动物除了不接受低氧处理外,其它处理均与CIHH组动物相同。离体心脏利用Langendorff灌流给予缺血(30min)/再灌注(60min)处理,观察心脏功能的变化。生化方法测定心肌SOD、CAT和GPX的活性及MDA的含量。免疫印迹方法测定心肌SOD及CAT的蛋白含量。 结果: 1基础状态下, CIHH组心肌MDA含量与non-CIHH组相比无显著性差异。心脏停灌缺血30min后再灌注60min,各组MDA含量均明显升高,CIHH组MDA含量升高明显低于相应non-CIHH组(P0.01)。 2基础状态下, CIHH组心肌总SOD、SOD-2和CAT活性较non-CIHH组相比均明显增加,SOD-1和GPX活性与non-CIHH组相比无显著性差异。心脏停灌缺血30min后再灌注60min ,各组总SOD、SOD-1、SOD-2和CAT活性MDA含量均明显下降,但CIHH组总SOD、SOD-2和CAT活性仍明显高于相应non-CIHH组(P0.01)。 3预先应用CAT不可逆性阻断剂,可完全消除CIHH对缺血/再灌注心脏的保护作用;应用抗氧化酶复合物SOD+CAT可模拟CIHH的心肌保护作用。 4 CIHH可对抗外源性H2O2引起的心功能降低及氧化应激。小结:CIHH通过上调抗氧化酶而发挥心肌保护作用。 第三部分钠钾泵在CIHH心脏保护中的作用 目的:探讨钠钾泵在CIHH心脏保护中的作用。 方法:雄性成年豚鼠(250±20g)随机分为两组:非间歇性低氧组(non-CIHH)与间歇性低氧组(CIHH)。CIHH处理组动物于低压氧舱分别接受14,21,28,42天, 5000米海拔高度(PB=404 mmHg, PO2=84 mmHg)的低压低氧处理,每天6小时。non-CIHH组动物除了不接受低氧处理外,其它处理均与CIHH组动物相同。利用膜片钳技术记录心肌细胞钠钾泵电流。利用细胞动缘探测系统测定心肌细胞的长度及收缩力的大小。 结果: 1模拟缺血20分钟再灌30分钟可明显缩短细胞的长度,但CIHH组细胞缩短的长度明显小于相应non-CIHH组的细胞。Oua可取消CIHH的作用。 2模拟缺血20分钟再灌30分钟可明显降低细胞的收缩幅度、细胞的最大收缩速率及最大舒张速率,但CIHH组细胞收缩的幅度、细胞的最大收缩速率及最大舒张速率恢复明显优于相应对照组。Oua可取消CIHH对细胞的收缩幅度,细胞的最大收缩速率的作用。 3与相应non-CIHH组相比,CIHH处理21,28,42天明显增加心肌细胞钠钾泵电流。 4 non-CIHH组△Ip-[Oua]关系曲线,从10-10到10-3 mol/LOua所对应的△Ip分别是0.088±0.03、0.150±0.03、0.060±0.01、-0.145±0.02、-0.391±0.06、-0.670±0.02、-0.98±0.01和-1.000±0.00。采用双亚基三位点结合模型可进行最优拟合,其解离常数(kd)包括高亲和力兴奋性位点Kd值(K+2)、高亲和力抑制性位点Kd值(K-2)和低亲和力抑制性位点Kd值(K1),分别为8.5 x 10-11M、5.2 x 10-8M和1.1 x 10-5M,高、低两种亲和力泵所占比例分别为f2 = 0.31和f1 = 0.68. CIHH组△Ip-[Oua]关系曲线,从10-10到10-3 mol/LOua所对应的△Ip分别是0.069±0.02、-0.036±0.03、-0.181±0.02、-0.202±0.05、-0.459±0.03、-0.770±0.02、-0.978±0.01和-1.000±0.00。采用双亚基三位点结合模型可进行最优拟合,其解离常数K+2、K-2和K1分别为2.4 x 10-10M、4.2 x 10-8M和2.8 x 10-6M, f2 = 0.20和f1 = 0.80。说明经CIHH处理后钠钾泵低亲和力泵即α1亚基的相对比例增加。 5 CIHH处理28天使心肌细胞钠钾泵电流明显增强,当给予H2O2 (1mM)灌流5分钟时钠钾泵电流在non-CIHH组与CIHH组均明显降低。但CIHH组钠钾泵电流仍明显高于相应non-CIHH组(P0.01)。 6 0.1mM H2O2在non-CIHH组可明显抑制钠钾泵电流,而对CIHH组与CAT组钠钾泵电流无明显影响。1mM H2O2对各组钠钾泵电流均有明显抑制,但CIHH组及CAT组钠钾泵电流仍明显高于相应non-CIHH组(P0.01)。1mM H2O2对各组的钠钾泵电流抑制基本已达到最大。但CIHH的最大抑制率明显低于non-CIHH组,CAT组的最大抑制率与non-CIHH组相比无明显差别。即CAT使H2O2与钠钾泵电流关系曲线平行右移,CIHH使H2O2与钠钾泵电流关系曲线右移,说明经CIHH处理后钠钾泵本身对H2O2的敏感性发生变化。 小结:钠钾泵在CIHH心肌保护中发挥了重要作用。 结论 1 CIHH可明显改善豚鼠心肌缺血/再灌注损伤 2 CIHH通过上调抗氧化酶的含量及活性而提高机体的抗氧化能力,这可能是其改善心肌缺血/再灌注损伤的机制之一。 3 CIHH可增强钠钾泵电流及降低钠钾泵对氧化应激的敏感性,钠钾泵在CIHH的心肌保护作用中发挥重要作用。