辛伐他汀对兔缺血再灌注后左心室肌细胞离子通道活性的影响

【摘要】： 目的:经皮冠状动脉介入治疗(PCI)技术,是急性心肌梗死治疗史上里程碑式的进步,然而随之带来的再灌注损伤直接影响到患者的预后。心肌缺血后发生再灌注可产生再灌注心律失常,特别是室速、室颤是导致心源性猝死的主要危险因素,约占心血管死亡事件的50%左右。因而缺血再灌注(I-R)心律失常是目前的研究热点之一。近年来研究表明他汀治疗有抗心律失常作用,但机制尚不明确。本研究以酶解法分离兔I-R后左心室肌细胞,应用膜片钳全细胞记录方法,研究I-R后梗死区和非梗死区心肌细胞钠通道电流(INa)、L型钙通道电流(ICa-L)、瞬间外向钾电流(Ito)活性的变化及辛伐他汀对各通道电流的影响,探讨辛伐他汀抗心律失常的离子机制。 材料与方法: 1实验动物:新西兰纯种大耳白兔45只,从河北医科大学实验动物中心购买,雌雄不拘,体重2.0～2.5kg。随机分为三组:假手术对照组,I-R组和他汀组。 2模型制作:采用开胸结扎兔冠状动脉左前降支,30分钟后,放松结扎线后再灌注120 min的方法建立急性I-R模型。他汀组术前给予辛伐他汀(5 mg·kg-1·d-1),口服3天,I-R组和假手术对照组术前给予安慰剂口服3天,其中假手术对照组开胸后分离冠状动脉左前降支,并不结扎血管。在组织病理学染色中,急性I-R模型的缺血时间为3小时,再灌注时间为60 min。 3心律失常评分标准:(1)0分,无心律失常;(2)1分,偶发性室性早搏;(3)2分,频发性室性早搏;(4)3分,偶发性室性心动过速;(5)4分,频发性室性心动过速;(6)5分,频发性室颤。 4细胞分离:利用酶解(胶原酶,Sigma公司)的方法分离心室肌细胞,梗死区细胞(指梗死区周围存活细胞)来源于心脏冠状动脉左前降支毗邻的左心室前壁梗死区部位,非梗死区为左心室游离壁与心梗区相对应区域,正常对照组细胞则取自正常兔心室与梗死区相对应的部位。 5电流记录:应用膜片钳全细胞记录方法,记录他汀组和I-R组梗死区和非梗死区心肌细胞INa、ICa-L和Ito活性的变化,并与假手术对照组进行比较分析。电流记录的刺激程序由pulse+ pulsefit软件控制,通道信号经EPC-9膜片钳放大器放大,通过Ag-AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞,产生的电流信号经EPC-9转换,为pulse+ pulsefit软件采集、分析,采集的数据用Origin 7.5拟合。 6组织病理学研究:心肌梗塞面积TTC染色并比较各组梗死区占横断面积的百分比。 7统计学处理:计量数据以x±s表示,组间均数比较采用方差分析,计数资料以率表示,采用四格表的Fisher确切概率法。所有数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,以P 0.05作为显著性差异的指标。 结果 1辛伐他汀对I-R中心律失常的影响 假手术对照组在观察期内仅偶尔出现室性早搏,未发生室性心动过速(室速)和心室颤动(室颤)。I-R组在心肌缺血时,心电图ST段明显抬高,可出现室性早搏(室早)、室速和室颤等心律失常;在再灌注即刻,出现较为严重的室速和室颤,此后随着再灌注时间的延长,兔心电图ST段明显恢复,心肌缺血改善,心律失常(室速、室颤)的发生减少。与对照组比较,I-R组心律失常的评分明显增加(P0.01)。辛伐他汀组兔在I-R期间,也可出现室早、室速(但无室颤)等心律失常,与I-R组相比,其持续时间明显缩短,发生率及心律失常评分明显降低(P0.01)。 2辛伐他汀对离子通道电流的影响 2.1 I-R组和辛伐他汀组在梗死区与非梗死区之间的INa电流密度峰值的比较 INa电流密度峰值(-30 mV)的比较显示:I-R组的梗死区与非梗死区INa电流密度峰值(-30 mV)分别为–22.46±5.32 ( n= 12 ),– 41.89±2.84(pA/pF)( n=14),梗死区较非梗死区,明显下降(P0.01);I-R组和辛伐他汀组的梗死区与非梗死区INa电流密度峰值(–30 mV)之间的差值分别为–19.43,–1.60(pA/pF),他汀组较I-R组明显减少(P0.01)(见Fig1)。 2.2辛伐他汀对梗死区心肌INa的影响 2.2.1辛伐他汀对INa及I–V曲线的影响采用维持电位(Holding potential,HP)-90 mV,阶跃+10 mV,从-80 mV逐步去极化到+60 mV,刺激频率0.5 Hz,钳制时间50 ms,引出INa。以不同钳制电压下的INa电流密度绘成电流密度-电压关系(I-V)曲线。图2示3组心室肌细胞典型的INa形态曲线。图3示3组细胞INa的I-V曲线,均在-60 mV激活,-30 mV达峰值,+40 mV时反转。I-R组与对照组相比,I-V曲线上移。他汀组与I-R组相比,I-V曲线下移,接近对照组。但INa电压依赖性不变,对激活电位、峰值电位、反转电位及I-V曲线的形态轨迹均无影响。 INa电流密度峰值(-30 mV)的比较显示:对照组、I-R组、他汀组INa电流密度峰值(-30 mV)分别为–42.78±5.48 (n=16),–22.46±5.32 (n=12),–40.66±5.89 pA/pF (n=15),I-R组较对照组明显下降(P0.01),他汀组较I-R组明显升高P0.01。他汀组与对照组相比,无明显差异(P0.05)。I/R可导致INa明显下降,辛伐他汀治疗可逆转这种变化。 2.2.2辛伐他汀对INa稳态失活曲线的影响图3示INa电压依赖性稳态失活曲线,I-R组与对照组相比,失活曲线明显左移(即向超极化方向移动),与I-R组相比,他汀组向右移,接近对照组。对照组的半数失活电压(V0.5)为–76.71±0.48 mV(n=16 ),I-R组为–91.66±0.42 mV(n=12),与对照组比较有明显差异(P0.05);辛伐他汀组的V0.5为–80.53±0.75 mV(n=15),较I-R组明显右移(P0.05),但与对照组比较无统计学差异(P0.05)。对照组,I-R组及辛伐他汀组的失活曲线斜率K(mV)分别为8.25±0.42 mV(n=16),8.71±0.36 mV(n=12),9.11±0.64 mV(n=15),三组间比较无统计学差异(P0.05)。 2.2.3辛伐他汀对INa失活后再恢复曲线的影响图5示3组细胞INa失活后再恢复过程的形态曲线,图6示INa失活后再恢复曲线。INa失活后再恢复曲线的时间常数τ(ms)的比较显示:对照组、I-R组、他汀组τ值分别为76.03±16.72 (n=16), 102.19±41.29 (n=12), 83.16±34.41 ms(n=15),I-R组较对照组明显升高(P0.01),他汀组较I-R组明显降低(P0.01)。他汀组与对照组相比,无明显差异(P0.05)。缺血再灌注可导致INa失活后再恢复时间延长,辛伐他汀治疗可逆转这种变化。 2.3辛伐他汀对梗死区心肌ICa-L的影响 2.3.1辛伐他汀对ICa-L及I–V曲线的影响 从HP -50 mV始,阶跃+10 mV,逐步去极化到+40 mV,时程250 ms,引出ICa-L。以不同钳制电压下的ICa-L电流强度绘成I-V曲线。记录ICa-L时,HP在-50 mV,钳制电压也保持不低于-50 mV,可抑制钠通道的活性,同时使T型钙通道失活。灌流液中加入4-AP、CsCl以去除钾电流,给予无K+、Na+灌流液以进一步去除钠钾电流的干扰。电极内液中加入EGTA以螯合钙离子,减慢电流失活。电流均在细胞破膜后10～20 min之间记录,避免ICa-L的衰减(run down)现象造成误差。 图7示3组心室肌细胞典型的ICa-L形态曲线。图8示3组细胞ICa-L的I-V曲线,均在-40 mV激活,0 mV达峰值,+50 mV时反转。I-R组与对照组相比,I-V曲线上移。他汀组与I-R组相比,I-V曲线下移,接近对照组。但ICa-L电压依赖性不变,对激活电位、峰值电位、反转电位及I-V曲线的形态轨迹均无影响。 ICa-L电流密度峰值(0 mV)的比较显示:对照组为–3.13±1.22 pA/pF(n=16),I-R组为–4.34±0.92 pA/pF(n=15),较对照组显著升高(P0.05);他汀组为–3.46±0.85 pA/pF(n= 13),与I-R组相比,明显下降(P0.05)。他汀组与对照组相比,无明显差异(P0.05)。缺血再灌注可导致ICa-L明显升高,辛伐他汀治疗可逆转这种变化。 2.3.2辛伐他汀对ICa-L稳态失活曲线的影响 图9示,I-R组、辛伐他汀组与正常对照组相比,ICa-L失活曲线明显左移(即向超级化方向移动),以I-R组左移更加明显。对照组V0.5为-16.27±0.92mV(n=16),I-R组为-28.56±0.92mV(n=15),与对照组比较相差显著(P0.01)。他汀组为-22.40±0.81 mV(n=13),与对照组比较显著增大(P0.01)。ICa-L稳态失活曲线斜率K(mV):对照组为6.34±0.80 mV(n=16),I-R组为11.42±0.75mV(n=15),与对照组相比明显增加(P0.01);辛伐他汀组k为10.67±0.68mV(n=13),与对照组比较显著增大(P0.01),但和I-R组比较无统计学差异(P0.05)。 2.4辛伐他汀对梗死区心肌Ito的影响 2.4.1辛伐他汀对Ito及I–V曲线的影响 HP为-60 mV,阶跃+10 mV,脉宽300 ms,给予从-40 mV到+60 mV的去极化脉冲记录Ito,以不同钳制电压下的Ito电流密度绘成I-V曲线。Ito幅值为其峰值与刺激结束稳态值的差值。图10示3组细胞典型的Ito形态曲线。图11示3组细胞Ito的I-V曲线,均呈线性电压依赖性。与对照组相比,I-R组I-V曲线明显下移,他汀组较I-R组I-V曲线明显上移。 Ito电流密度(+60 mV时)的对比显示:对照组为17.41±3.13 (n=15) ,I-R组为9.49±1.91 (n=11),与对照组相比显著下降(P0.01)。他汀组为14.54±2.41 (n=11),与I-R组相比显著升高(P0.01),但仍明显小于对照组,(P0.05)。缺血再灌注可导致Ito明显下降,辛伐他汀治疗可在一定程度上逆转这种变化。 2.4.2辛伐他汀对Ito稳态失活曲线的影响 图12示,I-R组、辛伐他汀组与正常对照组相比,Ito失活曲线向左移动(即向超级化方向移动),以I-R组左移更加明显。对照组V0.5为-45.98±1.94mV(n=15),I-R组为-55.41±1.58mV(n=11),与对照组比较显著增大(P0.05)。他汀组为-47.91±2.17 mV(n=11),低于I-R组(P0.05),但与对照组比较无统计学差异(P0.05)。对照组,I-R组及辛伐他汀组Ito稳态失活曲线斜率K(mV)分别为:为16.73±1.46 mV(n=15),16.31±1.07 mV(n=11),17.05±1.58mV(n=11),三组间比较无统计学差异(P0.05)。 3各组病理TTC染色结果 图13示各组病理中梗死区所占横断面积的百分比:I-R组、格列苯脲-他汀组、他汀组分别为(28.17±2.31)% (n=5), (17.16±0.35)% (n=5),(5.34±0.72)% (n=5);I-R组较格列苯脲-他汀组明显增加(P0.01),他汀组和其它两组比较明显减少(P0.01)。缺血再灌注可导致心肌坏死,辛伐他汀治疗可保护缺血区心肌。 结论 1动物实验表明他汀类药物明显降低缺血再灌注心律失常的发生率。 2缺血再灌注可导致缺血心肌细胞INa和Ito明显下降,ICa-L.明显增加,形成电重构,可引起心肌细胞动作电位延长,并且不同区域之间存在电生理异质性,为再灌注心律失常发生的机制。辛伐他汀预治疗可减轻这些离子通道的异常变化,逆转电重构,而不依赖于其降血脂效应,可能为他汀类药物降低心律失常发生率的细胞学离子机制。所以,阻断或逆转异常电重构的形成,应当成为临床治疗心律失常的一个新的重要靶点。并且本研究扩展了他汀类药物的多效性。 3该研究证明辛伐他汀可以缩小心肌梗死面积,推测其机制与ATP敏感性钾通道开放有关。