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应用膜片钳技术对人食管下括约肌L型钙离子通道的研究

张石英  
【摘要】: 目的:1979年Liebermann-Meffer等学者通过对32例尸体食管胃连接部(esophagogastric junction, EGJ)标本的解剖学研究,从而详细阐述了食管胃连接部平滑肌束的大体排列方式,进而提出了人类食管下括约肌(lower esophageal sphincter, LES)是由钩状纤维(clasp fiber)和套索纤维(sling fiber)共同构成的这一理论。Liebermann-Meffert等学者认为这两种纤维共同维持了LES的静息高压状态,从而形成了LES高压带(high-pressure zone, HPZ, 15~30mmHg)。这一发现为进一步对LES的病理、药理以及生理学特性奠定了解剖学基础。随后学者们对不同动物的LES的功能调节机制和生理学特点进行了更为深入的研究。 目前已被公认,平滑肌细胞胞浆游离Ca2+在平滑肌收缩过程中起着极为重要的“第二信使”作用。细胞内游离钙浓度的变化是Ca2+跨细胞膜转运和细胞内贮钙池(肌浆网、线粒体、内质网等)摄取、释放钙等过程中动态平衡改变的结果。平滑肌细胞的收缩活动依赖于胞浆中Ca2+的浓度,低浓度的Ca2+引起平滑肌的舒张,高浓度的Ca2+引起平滑肌的收缩。引起平滑肌收缩的Ca2+主要来源于细胞内肌质网和细胞外液的Ca2+。一般认为,细胞外钙跨膜进入细胞是细胞内钙释放的触发因素,细胞内Ca2+增加主要取决于细胞内钙离子的释放。细胞外液的Ca2+可通过细胞膜上的电压依赖性钙离子通道(voltage dependent calcium channel,VDCC)进入细胞。电压依赖性钙通道可以分为L型、T型、N型等亚型。在平滑肌细胞膜上主要有L型和T型两种电压门控式钙通道。与L型钙通道有所不同的是,T型钙离子通道的密度与细胞生长有关,正常情况下机体内平滑肌细胞膜上的T型钙离子通道只有很少量的表达。L型钙通道具有细胞外钙离子浓度依赖性,并且L型钙通道的电流随细胞外钙浓度的增加而增加。钙离子通道普遍存在于所有可兴奋以及一些非可兴奋细胞甚至原核生物细胞膜上。与骨骼肌、心肌舒缩的机制相类似,L型钙离子通道在平滑肌细胞的舒缩机制中起着关键作用。当平滑肌细胞膜去极化时,通过L型钙离子通道进入细胞内的Ca2+是平滑肌细胞收缩的主要触发因素。 1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术(patch clamp recording technique) ,膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。自从上世纪80年代开始应用于细胞膜离子通道研究以来,不仅为从分子水平了解细胞单离子通道的开放或关闭的动力学、膜选择通透和兴奋性提供了直接手段,而且也为我们从离子通道水平阐明某些疾病的发生机制以及药物作用机制提供了直接检测手段。 本研究应用细胞膜片钳技术对人类LES平滑肌细胞膜上钙离子通道的类型以及常见的影响因素进行分析,并深入探讨套索纤维和钩状纤维可能具有的不同生物学特征及其内在调节机制。可以预见,对于LES的电生理研究将有助于对贲门失弛症、食管下括约肌高压症等食管运动功能障碍性疾病,以及胃食管返流病(gastroesophageal reflux disease GERD)等食管良性疾病病因的理解以及治疗方法的改进。 方法:选取自2008年11月到2009年12月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术的患者25例。其中,男性17例,女性8例,平均年龄54.2岁。从手术室采取新鲜手术标本,锐性剥离贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,剪取套索纤维及钩状纤维肌条,并把肌条剪成体积为2mm3小块,用含胶原酶II和木瓜酶的细胞分离液分离出单个平滑肌细胞。确认细胞存活率在95%以上。然后保存于37℃Hepes缓冲液中备用。 细胞存活率测定:用滴管吸取5滴细胞悬浮液,加入1滴0.2%的台盼蓝溶液,并于混匀后3分钟以内计数,死亡的细胞将会被染成红色,而活细胞仍能保持无色状态。细胞存活率计算公式:存活率(%)=活细胞总数/(活细胞数+死细胞数)×100%。 将细胞灌流槽固定在倒置显微镜的工作台上,吸取数滴平滑肌细胞悬液滴于灌流槽中,静置5分钟,待细胞贴壁后,用与钙电流相应的灌流液灌流,冲洗掉死亡悬浮的细胞,选取附壁的、表面光滑整洁的、边缘整齐的、静止不动的、立体感强的细胞作为研究对象。电极由硬质玻璃毛坯经水平拉制仪(Sutter P-97,USA)四步拉制而成,充以钙离子电极內液后阻抗为2~3MΩ。用三维液压微操纵器移动电极并贴近所选取的细胞进行封接。封接成功后,通过抽吸所造成的负压吸引使电极尖端内的细胞膜破裂,电极内液和细胞内液相通,从而在电极与细胞膜之间形成1G?以上的高阻抗封接,调节快补偿以抵消电极夹持器与电极管壁的电容,再对电极施加负压吸破细胞膜,见电容放电突然增大并伴有噪声增大形成全细胞记录模式,调节慢电容补偿和串联补偿以减少瞬时充放电电流和钳位误差。 脉冲信号由pulse+ pulsefit软件(HEKA,version8.53,法耳次,德国)控制,通道信号用EPC-9膜片钳信号放大器(HEKA,法耳次,德国)放大,通过Ag-AgCl电极丝和填充电极內液的微电极导入细胞,产生的电流信号通过EPC-9转换,被pulse+ pulsefit软件所收集、分析,收集到的数据采用Origin7.5拟合。所有实验均在室温(25℃)下进行。所得数据均以均数±标准差表示,两组均数的比较采用t检验进行统计学分析,通过软件SPSS14.0(SPSS公司,芝加哥,美国)完成。以P0.05为差异认为在统计学上有显著性意义。 结果: 1食管下段括约肌细胞的形状 在倒置显微镜下观察,新鲜分离的食管下括约肌套索纤维和钩状纤维平滑肌细胞均呈梭形,大小不一,长短各异。在Hepes缓冲液中置于高倍镜下观察,部分细胞舒张,部分细胞处于不同程度的收缩状态。套索纤维和钩状纤维平滑肌细胞均只有一个中心性核仁。套索纤维细胞平均长度为99.8±25.4μm(53~151μm,n=200);钩状纤维平滑肌细胞平均长度为100.5±26.9μm(45~143μm,n=200)。两者相比较无统计学意义(t=0.244,P=0.676)。 2 I-V曲线 分别将选定细胞钳制在-90mV和-60mV,并以10mV的阶跃从-80mV到+30mV,时程200ms刺激细胞去极化。此时可记录到一内向电流,在约-50mV处反转。两次不同钳制电压的IV曲线均呈U型,不过峰值不同,在钳制电压为-90mV时的内向电流-7.11±1.01pA/Pf (n=6)。钳制电压为-60mV时为-5.75±1.49pA/Pf(n=6)显著低于钳制电压为-90mV时的内向电流-7.11±1.01pA/Pf (n=6)。两者相比较有统计学意义(t=2.142,P=0.041)。而且套索纤维平滑肌细胞与钩状纤维平滑肌细胞所记录到的钙电流未发现明显不同。 3乙酰胆碱对钙离子内向电流的影响 乙酰胆碱可以明显激活L型钙离子通道,引起钙电流峰值增大。加入1μmmol/L的乙酰胆碱后钳制电压为-60mV和-90mV的峰值分别为-9.21±0.94pA/Pf(n=6)和-9.89±1.32pA/Pf(n=6)。正常电流峰值在钳制电压为-60mV和-90mV时分别为-5.75±1.49pA/Pf(n=6)和-7.11±1.01pA/Pf(n=6)。两者相比较分别为(t=8.142,P=0.000)及(t=8.851,P=0.000)。在乙酰胆碱浓度为5μmmol/L和10μmmol/L时也具有相同趋势。 结论: 1钩状纤维细胞与套索纤维细胞的大小、形态基本相同,未发现有明显差异。 2人食管下段括约肌的内向电流主要通过L型钙离子通道进入细胞,除L亚型外的其它亚型不起主要作用。 3乙酰胆碱可以使钙通道开放时间延长,开放概率增加,可以明显增强钙离子内向电流。


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