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高糖对人晶状体上皮细胞中NF-κB的作用

李恩  
【摘要】: 目的:糖尿病性白内障(Diabetic cataract)是糖尿病患者失明的主要因素之一。临床观察表明,糖尿病患者的老年性白内障发病率更高,发病年龄较非糖尿病者更为提前,而且成熟更为迅速,即糖尿病因素可以使白内障提早出现或加速其发展。然而,目前糖尿病性白内障的发病机制尚不完全清楚。近年来一系列基础和临床研究显示,糖尿病情况下存在着明显的氧化应激,氧化应激是晶状体上皮细胞损伤的重要因素。 本实验小组前期研究结果显示,糖尿病时,大鼠晶状体上皮细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) mRNA和蛋白表达明显上调,iNOS活性显著增高,其合成的一氧化氮(nitric oxide,NO)大量增加。过量产生的NO与超氧阴离子(superoxide, O2-)快速反应生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)。ONOO-可有效硝基化蛋白质的酪氨酸残基,形成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine, 3-NT)。3-NT被公认为ONOO-形成的特异性标志。蛋白质被ONOO-硝基化后,它们的结构和功能就会受到影响,增强或抑制则取决于不同的蛋白质。 本实验小组前期试验证明,糖尿病中,ONOO-可引起iNOS和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的蛋白质硝基化,加重对糖尿病血管的损伤。已知NF-кB是iNOS的上游调控因子,目前发现NF-кB家族存在5种蛋白,包括p65(Rel-A),c-Rel,Rel-B, p50(其前体蛋白为p105)和p52(其前体蛋白为p100)。NF-кB蛋白家族通常以同源或异源二聚体形式存在,其中p50-p65二聚体是最广泛的存在形式。当细胞处于未受刺激时,p50-p65二聚体与NF-кB抑制蛋白(Inhibitory kappa B protein,IкB)以三聚体的形式结合在一起,使NF-кB处于一种无活性状态,滞留于细胞质中。当细胞受到高糖刺激时,IкB激酶复合物(I-kappa B kinase complex,IKK)被激活,IкB的N-端被磷酸化,于是NF-кB得以被激活,移位进入细胞核,与DNA链上的特异кB序列结合,从而发挥调控基因转录的活性。那么,在高糖状态下,晶状体上皮细胞中NF-кB的核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平如何?关于这方面的研究尚未见报道。 3-吗啉-斯德酮亚胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)是ONOO-的特异供体。 四磺基苯基铁卟啉(5,10,15,20-Tetrakis-(4-sulfonatophenyl)porphyrinato-iron(III),FeTPPS)是ONOO-的分解催化剂。 本实验采用人晶状体上皮细胞株SRA01/04,应用高糖模拟糖尿病高糖状态模型,从细胞水平,应用不同浓度的葡萄糖、ONOO-的供体SIN-1、ONOO-的分解催化剂FeTPPS进行实验。实验中,以NF-кBp65亚基为检测标准来测定NF-кB的核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平,从而为进一步研究硝基化对NF-кB与DNA结合活性及对NF-кB靶基因(如iNOS和COX-2)活性的影响奠定基础。 方法: 1细胞培养 配置低糖DMEM培养基和0.25%的胰蛋白酶消化液,用含10%新生牛血清和1%非必需氨基酸的低糖DMEM培养基,在37℃、5%CO2培养箱中进行细胞培养和传代。 2实验设计与分组 2.1探讨高糖(25mmol/L)对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位和核内蛋白含量的影响。用25mmol/L的高糖培养液孵育SRA01/04细胞,按照不同作用时间分为9组:0、5、10、15、20、25、30、35、40min组。 2.2探讨不同浓度葡萄糖对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平的影响。实验分为5组:5.5、10、15、20、25、30mmol/L组。作用时间为20min。 2.3探讨ONOO-对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平的影响。用SIN-1作为ONOO-供体,按照不同浓度分为6组:0、10、50、100、250、500μmol/L组。作用时间为20min。 2.4探讨高糖(25mmol/L)状态下,清除ONOO-后对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平的影响。用25mmol/L的高糖培养基孵育SRA01/04细胞,用FeTPPS作为ONOO-的分解催化剂,按照FeTPPS的不同浓度分为6组:0、5、10、25、50、100μmol/L组。作用时间为20min。 3 NF-кBp65核转位的形态学观察。 免疫荧光染色法观察SRA01/04细胞中NF-кBp65亚基是否转运到细胞核内从而确认NF-кB是否被活化。 4细胞核内NF-кBp65的蛋白含量及其硝基化水平的检测。 提取各组核蛋白后,Lowry法进行核蛋白定量,Western blotting检测各组细胞核内NF-кBp65的蛋白含量及其硝基化水平,即NT含量。 结果: 1高糖(25mmol/L)对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位和核内蛋白含量的影响。 免疫荧光显示,正常组(0min)NF-кBp65主要分布在细胞浆内,细胞核内未见或很少(NF-кBp65在胞浆中为失活状态,在核中为活化状态)。高糖(25mmol/L)与SRA01/04细胞孵育不同时间后,高糖呈时间依赖性增加细胞中NF-кBp65核转位,其中以20min作用最为明显。 Western blotting结果显示,5min时核内NF-кBp65的蛋白含量(2.38±0.39)、10min时核内NF-кBp65的蛋白含量(2.23±0.45)、15min时核内NF-кBp65的蛋白含量(2.33±0.41)、20min时核内NF-кBp65的蛋白含量(2.99±0.62)、25min时核内NF-кBp65的蛋白含量(2.37±0.35)较正常对照组核内NF-кBp65的蛋白含量(1.50±0.32)显著增加(P0.05)。其中,以20min时核内NF-кBp65的蛋白含量增加最为明显(P0.05)。内参组蛋白(Histone)表达基本一致。(见Fig.1和Fig.2) 2不同浓度葡萄糖对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平的影响。 免疫荧光显示,正常组(5.5mmol/L) NF-кBp65主要分布在细胞浆内,细胞核内未见或很少。不同浓度葡萄糖与SRA01/04细胞共孵育20min后,呈浓度依赖性增加NF-кBp65核转位。其中以20mmol/L葡萄糖组和25mmol/L葡萄糖组作用较为明显。 Western blotting结果显示,10mmol/L葡萄糖组的核内NF-кBp65的蛋白含量(2.29±0.29)及其硝基化水平(3.18±0.46)和15mmol/L葡萄糖组的核内NF-кBp65的蛋白含量(2.42±0.36)及其硝基化水平(3.27±0.47)较正常组核内NF-кBp65的蛋白含量(1.67±0.31)及其硝基化水平(2.02±0.48)增加较为明显(P0.05),两组间无明显差异。20mmol/L葡萄糖组的核内NF-кBp65的蛋白含量(2.50±0.41)及其硝基化水平(4.62±0.62)和25mmol/L葡萄糖组的核内NF-кBp65的蛋白含量(2.69±0.37)及其硝基化水平(4.17±0.57)较其他组核内NF-кBp65的蛋白含量增加最为明显(P0.05),两组间无明显差异。提示20mmol/L和25mmol/L葡萄糖对NF-кBp65的核内蛋白含量和硝基化水平影响最明显。内参Histone表达基本一致。(见Fig.3和Fig.4) 3不同浓度SIN-1对SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平的影响。 免疫荧光显示,正常组(0μmol/L SIN-1) NF-кBp65主要分布在细胞浆内,细胞核内未见或很少。不同浓度SIN-1与SRA01/04细胞共孵育20min后,呈浓度依赖性增加NF-кBp65核转位。其中以50μmol/L SIN-1组和100μmol/L SIN-1组作用较为明显。 Western blotting结果显示,10μmol/L SIN-1组的核内NF-кBp65的蛋白含量(1.34±0.37)及其硝基化水平(0.66±0.11)较正常组核内NF-кBp65的蛋白含量(0.68±0.19)及其硝基化水平(0.28±0.07)增加较为明显(P0.05)。50μmol/L SIN-1组的核内NF-кBp65的蛋白含量(1.87±0.35)及其硝基化水平(0.95±0.18)和100μmol/L SIN-1组的核内NF-кBp65的蛋白含量(2.40±0.63)及其硝基化水平(1.08±0.19)较其他组核内NF-кBp65的蛋白含量增加最为明显(P0.05),两组间无明显差异。0μmol/LSIN-1组、250μmol/LSIN-1组、500μmol/LSIN-1组三组之间无明显差异。提示50~100μmol/L为SIN-1作用的最有效浓度范围。内参Histone表达基本一致。(见Fig.5和Fig.6) 4不同浓度FeTPPS对高糖(25mmol/L)状态下SRA01/04细胞中NF-кBp65核转位、核内蛋白含量及其硝基化水平的影响。 免疫荧光显示,正常组(0μmol/L FeTPPS) NF-кBp65主要分布在细胞核内。不同浓度FeTPPS+25mmol/L高糖与SRA01/04细胞共孵育20min后,可见25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L FeTPPS三组中NF-кBp65核转位大量减少。 Western blotting结果显示,25μmol/L FeTPPS组的核内NF-кBp65的蛋白含量(1.63±0.28)及其硝基化水平(0.38±0.09)、50μmol/L FeTPPS组的核内NF-кBp65的蛋白含量(1.62±0.42)及其硝基化水平(0.44±0.12)及100μmol/L FeTPPS组的核内NF-кBp65的蛋白含量(1.35±0.38)及其硝基化水平(0.34±0.09)较正常组核内NF-кBp65的蛋白含量(2.51±0.26)及其硝基化水平(0.88±0.17)降低较为明显(P0.05)。这三组之间无明显差异。提示25~100μmol/L为FeTPPS的最有效浓度范围。0μmol/L、5μmol/L和10μmol/L FeTPPS这三组之间无明显差异。内参Histone表达基本一致。(见Fig.7和Fig.8) 结论: 1高糖可引起人晶状体上皮细胞中NF-кB的核转位。 2高糖状态下,人晶状体上皮细胞中NF-кB的核内蛋白含量增加。 3高糖可致人晶状体上皮细胞中NF-кB的硝基化。


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