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维生素D预防溃疡性结肠炎复发的作用与机制研究

麻继臣  
【摘要】: 溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是一种病因不明的肠道慢性炎症性疾病,近年来在我国近年呈高发趋势,高复发率是其突出特征。然而,由于基本机制不明,目前UC治疗的根本目标仍然是控制症状,诱导缓解。如何更有效的防治UC复发是临床亟待解决的问题。 近年UC发病机制的研究进展,给治疗学提供了新的启示。目前关于UC发病机制的基本共识是:易感个体在环境因素作用下,肠黏膜屏障削弱,肠道致病菌群及其有害成分穿过黏膜屏障,和有缺陷的免疫系统相接触,引发局部炎症反应,细菌不能被及时清除,使病情迁延反复。人体肠道处于复杂的带菌环境,肠黏膜表面积约有300m2,肠道内大约有500种共生菌,每克结肠内容物含有多达1012株共生菌,而易感个体肠黏膜屏障通透性显著升高,使细菌通过肠黏膜屏障的机会增加,由此可见,对于已经有遗传缺陷的个体,及时清除黏附于肠壁表面和偶然突破肠黏膜屏障的致病菌是防止疾病发生和复发的关键。 抗菌肽在维持肠道黏膜屏障不被细菌入侵中起决定作用。它是迄今发现的最强的杀菌剂,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和原虫均具有杀菌作用。防御素是人体肠道最主要的抗菌肽,结肠细胞主要表达防御素-1(humanβ-defensin 1, HBD-1)和防御素-2(humanβ-defensin 2, HBD-2)。 研究表明,维生素D在调控防御素表达中起关键作用,流行病学调查发现UC患者普遍存在维生素D缺乏,动物实验证实维生素D受体基因敲除的小鼠更容易诱导出结肠炎,且结肠炎症状因补充活性维生素D获得缓解。只有活化的维生素D才具有生物学效能,然而活性维生素D即1,25-(OH)2D3循环浓度仅为0.03~0.06ng/ml,而其发挥抗菌作用所需生物作用浓度高达循环浓度数十甚至上百倍,提示维生素D可能存在一种局部活化形式。2001年Zehnder D证实结肠上皮细胞存在维生素活化的关键限速酶—25-羟维生素D 1-α-羟化酶(25-Hydroxyvitamin D3 1-alpha-hydroxylase, CYP27B1),因而我们推测CYP27B1可能是维生素D对防御素局部调控的关键。为此我们进行了如下研究:①收集UC患者和正常人肠黏膜组织标本,检测CYP27B1、防御素-2(HBD-2)在肠黏膜中的表达及其相关性;②采用过表达策略,构建重组腺病毒载体Ad-CYP27B1并感染Caco-2细胞,观察高表达CYP27B1对Caco-2细胞HBD-2和HBD-2表达的影响;③对比观察维生素D联合5-氨基水杨酸(5-ASA)与单独应用5-ASA对缓解期UC病人累积缓解率的影响,评价活性维生素D作为缓解期维持治疗药物的效能。实验内容主要包括以下三部分: 第一部分CYP27B1在溃疡性结肠炎肠上皮组织中的表达及其与防御素-1、防御素-2的关系 目的:检测人类溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中CYP27B1和HBD-1、HBD-2在mRNA和蛋白水平的表达,探讨CYP27B1与防御素表达之间的关系,以及其在UC发病中的作用。 方法:①依据临床资料、血液生化指标及内镜表现,选择在河北医科大学第二医院消化内科诊断明确的活动期UC患者。②免疫组织化学方法检测UC和正常对照结肠组织中的表达。③real-time Q-PCR方法测定UC患者和正常对照结肠上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2在转录水平的表达。④Western blot检测UC患者和正常对照结肠上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2蛋白的表达。实验分组如下:(1)con组:正常结肠黏膜;(2)uninfl组:UC患者非炎症结肠黏膜;(3)infl组:炎症结肠黏膜。 结果:①UC患者35例,男19例,女16例。UC组轻度8例,中度18例,重度9例。②CYP27B1炎症黏膜组明显高于对照组(8.62±1.19 vs 5.14±0.86,P 0.01)及非炎症黏膜组(8.62±1.19 vs 5.86±0.74,P0.05)后两者之间无统计学差异(5.86±0.74 vs 5.14±0.86,P 0.05);HBD-1在对照组及UC患者结肠上皮均有表达,对照组显著高于UC患者非炎症部位和炎症部位(7.28±0.93 vs 5.29±1.03,P 0.05;7.28±0.93 vs 4.47±1.24, P 0.01 );HBD-2在炎症部位显著高表达,与对照组比较(7.41±1.32 vs 3.46±0.81,P 0.01)及非炎症部位比较(7.41±1.32 vs 3.55±1.15,P 0.01)均具有统计学意义;Pearson相关性检验表明,炎症黏膜组织中CYP27B1的表达与HBD-2的表达呈高度正相关(r=0.710,P0.01);③应用real-time Q-PCR技术检测各组CYP27B1、HBD-1和HBD-2的mRNA表达,并采用相对定量2-△△Ct法比较上述指标在各组结肠黏膜组织中的表达。以con组为对照组(其CYP27B1、HBD-1和HBD-2的mRNA表达量均为1),则uninfl组与infl组中CYP27B1 mRNA的表达量分别为1.355、5.559,HBD-1 mRNA的表达量分别为0.716、0.595,HBD-2的mRNA表达量分别为1.810、10.286。统计结果显示:infl组中CYP27B1、HBD2的mRNA的表达明显高于Con组(P0.01,P0.01),而HBD1的mRNA表达较con组显著降低(P 0.01);④Western blot分析CYP27B1蛋白在各组中的表达,结果显示:infl组(1.22±0.10)显著高于con组(0.84±0.06)及uninfl组(0.99±0.19),P0.05;而HBD-1蛋白在infl组(0.77±0.07)的表达显著低于con组(1.66±0.10)及uninfl组(1.39±0.10),P0.05,P0.01;HBD-2蛋白在infl组(0.87±0.04)的表达显著高于con组(0.11±0.04)及uninfl组(0.20±0.07),P0.01,P0.01。 结论:①CYP27B1,HBD-1和HBD-2在正常对照组织和非炎症黏膜组织及炎症黏膜组织中的表达有显著差异,其中CYP27B1和HBD-2在UC病变部位显著高表达,而HBD-1在UC患者正常及病变黏膜均低表达。提示三者可能参与了UC发病的病理过程;②UC患者病变部位HBD-2表达和CYP27B1的表达呈显著正相关,而HBD-1和CYP27B1的关联有待进一步证实。 第二部分CYP27B1腺病毒表达载体的构建及其体外促进防御素表达的效应观察 目的:探讨CYP27B1过表达对体外培养的Caco-2细胞HBD-1及HBD-2的调控作用。 方法:①重组腺病毒Ad-CYP27B1的构建:从Caco-2细胞提取RNA,经RT-PCR扩增得到目的基因CYP27B1片段,克隆至pTA2克隆载体,将测序正确的CYP27B1亚克隆至pAdTrack-CMV中后转化含pAdEasy-1的感受态BJ5183,通过同源重组获得腺病毒载体质粒,转染293包装病毒颗粒;②采用real-time Q-PCR技术和Western blot方法检测被感染的Caco-2细胞中CYP27B1的mRNA和蛋白表达以证实重组腺病毒Ad-CYP27B1的成功构建;③采用过表达策略,以腺病毒为载体,将Ad-CYP27B1及对照空病毒Ad-GFP转染体外培养的Caco-2细胞,分别采用real-time Q-PCR技术及Western blot检测Caco-2细胞中HBD-1及HBD-2在mRNA、蛋白表达水平的变化。实验分组如下:(1)con组,以含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞,在感染步骤加入无血清无抗生素DMEM代替病毒液;(2)Ad-GFP组,感染表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP;(3)Ad-CYP27B1组,感染携带CYP27B1基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-CYP27B1。 结果:①重组腺病毒CYP27B1的构建:成功扩增出1527bp大小的CYP27B1片段,经测序与预期序列一致,将测序正确的CYP27B1成功克隆至pAdTrack-CYP27B1后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,通过筛选、293细胞包装后获得了重组腺病毒Ad-CYP27B1,病毒滴度约为1011U/ mL②腺病毒感染Caco-2细胞后48 h,应用Real-time PCR检测Caco-2细胞CYP27B1 mRNA表达,并采用相对定量2-△△Ct法比较CYP27B1 mRNA在各组Caco-2细胞中的表达。以con组为对照组(其CYP27B1 mRNA表达量为1),Ad-CYP27B1组CYP27B1 mRNA的相对表达量为2.135,显著高于Con组(P0.01),而Ad-GFP组的CYP27B1 mRNA相对表达量为0.886,与Con组无显著差异(P0.05);进一步应用Western blot分析各组Caco-2细胞的CYP27B1蛋白表达,Ad-CYP27B1组(2.09±0.05)显著高于con组(1.52±0.09)及Ad-GFP组(1.35±0.13),P0.01。Ad-GFP组与con组间CYP27B1蛋白表达均无显著差异(P0.05),证明重组腺病毒Ad-CYP27B1成功感染体外培养的Caco-2细胞。③病毒感染Caco-2细胞后细胞状态良好,贴壁生长,无变圆、缩小或脱落等病理迹象,经过荧光倒置显微镜观察发现Ad-CYP27B1的转染效率在第24 h约48%,48 h约80%。④为评价CYP27B1对HBD1和HBD2的影响,在病毒感染Caco-2细胞48 h后,采用real-time Q-PCR及Western blot检测Caco-2细胞HBD1及HBD2在转录、蛋白表达水平的变化。结果显示Ad-CYP27B1组Caco2细胞HBD-1蛋白及其mRNA显著高于Con组(P0.05);HBD-2蛋白及其mRNA显著高于Con组(P0.01, P0.05). 结论: CYP27B1基因促进了HBD-1及HBD-2在Caco-2细胞的mRNA和蛋白表达,从而可能增强结肠上皮的抗菌功能,对维持结肠黏膜屏障功能完整起到保护作用。 第三部分维生素D对溃疡性结肠炎维持缓解的作用 目的:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是临床常见复发性疾病,目前尚无满意的缓解期治疗措施,标准治疗方案仅能将1年内累积复发率降为50%,研究显示UC发病和维生素D缺乏相关联,本研究的目的是对5-氨基水杨酸方案联合维生素D对维持缓解的效果进行前瞻、单盲的随机对照观察,探索其做为缓解期维持治疗方案的可行性,为UC缓解期治疗提供新的思路。 方法:将52例诱导缓解的溃疡性结肠病人,随机分为维生素D+美沙拉秦组(26人)和美沙拉秦组(26人),分别给予罗钙全0.25μg 1/日+美沙拉秦500mg 3/日或单独给予美沙拉秦500mg 3/日。终点事件为疾病复发。采用Kaplan - Meier法和Log–rank检验等统计方法对两组数据进行比较。 结果:试验截尾,两组之间的基本临床资料、复发率及累积缓解率无显著差异;对两组高复发率患者进行分层统计后,两组间缓解时间(V+M组,224±39天;MSL组134±27天,Student t test P=0.026)和累积缓解率(Log-rank test P =0.039)表现出统计学差异。 结论:维生素D联合美沙拉秦不能显著降低一般患者的累积复发率,但对高复发率患者,可能延长其缓解时间及累积缓解率。


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