收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

肿瘤免疫治疗中CTL细胞、Treg细胞及其相关性研究

张燕  
【摘要】: 目的:恶性肿瘤发病率增高,严重危害人类健康。目前针对肿瘤手术、放疗、化疗三大常规治疗方法却远远不能改变肿瘤治疗的现状。近年来随着分子生物学技术的发展、免疫学理论不断丰富,现代免疫学技术也在不断地推陈出新,人们从细胞和分子水平上对肿瘤与免疫系统的关系有了更深刻的认识,为肿瘤免疫疗法在临床上的应用奠定了坚实的基础。过继性细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy ACI)已经成为继手术、放疗和化疗后的第四种治疗模式。过继性细胞免疫疗法是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。目前以抗体疗法、T细胞疗法和肿瘤疫苗为代表的肿瘤被动免疫和主动免疫治疗,己经取得显著的进展,作为肿瘤治疗的辅助手段在临床上显示出光明的应用前景。 过继免疫治疗的关键在于筛选具有肿瘤特异性杀伤作用的效应细胞,对靶细胞即肿瘤细胞产生致命的杀伤,以实现过继免疫治疗高效低毒的特点。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte CTL)具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点成为过继免疫治疗中常用效应细胞而倍受关注。如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高过继免疫治疗效果的关键。 树突状细胞(DC)是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞,具有高效摄取、加工、递呈肿瘤相关抗原,并激活初始免疫反应的独特功能。本实验利用C57BL/6小鼠DC细胞与T细胞共同培养,并且负载B16黑色素瘤特异性抗原,以便获得数量更多、杀伤活性更高,更具有特异性的抗肿瘤效应细胞DC-CTL。 但是在体内试验中发现,抗肿瘤效应细胞在肿瘤微环境中通常被诱导进入“免疫无能”(immune anergy)状态,因此不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞,出现效应细胞与肿瘤细胞大量共存的尴尬局面。消除体内的免疫抑制细胞,充分发挥效应细胞的功能,对于提高肿瘤的治疗效果具有重要意义。 CD4~+CD25~+Treg细胞CD4~+细胞的新成员,目前较为常用的是根据产生的途径不同将CD4~+CD25~+Treg细胞分为自然产生的调节性T细胞(natural regulatory T cells nTreg)和诱导产生的调节性T细胞(induced regulatory T cells iTreg)两类。大量研究发现在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症患者的外周血、肿瘤浸润淋巴结中都可以检测出CD4~+CD25~+Treg细胞。CD4~+CD25~+Treg细胞可能通过识别肿瘤抗原后活化发挥其免疫抑制作用。CD4~+CD25~+Treg通过细胞间相互接触或分泌细胞因子等机制,抑制机体抗肿瘤免疫应答的产生,使机体处于对肿瘤低应答或无应答状态。这些研究说明CD4~+CD25~+Treg细胞对于肿瘤的免疫治疗是一个重要的障碍。因此寻找既能增强免疫效应细胞的抗肿瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+Treg细胞阻抑作用的方法,将是提高和改善肿瘤免疫治疗的一个崭新途径。 本研究将B16黑色素瘤特异性抗原致敏的成熟DC与T细胞共同培养,诱导生成具有肿瘤特异性免疫效应细胞DC-CTL。而且应用免疫磁珠分选的方法(magnetic cell sorting,MACS)去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分,从体外杀伤试验、体内的抑瘤效果、细胞形态学变化、对细胞增殖和凋亡的影响等多方面观察DC-CTL细胞的杀伤效果。同时比较于T细胞分化形成CTL的不同时期删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分对DC-CTL特异性杀伤效果的影响。从而探究DC-CTL细胞、Treg细胞在抗肿瘤免疫中所起的作用以及相互关系,为肿瘤的免疫治疗提供理论基础及实验室资料。 方法:本实验以C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤动物模型作为研究对象,制备黑色素瘤动物模型,并应用60Coγ对小鼠黑色素瘤动物模型进行照射,使小鼠机体达到非髓性淋巴细胞删除状态,则C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型的免疫细胞丧失。便于效应细胞回输完成免疫重建。 取小鼠脾脏制备DC和T细胞,B16黑色素瘤细胞采用冻融法制备肿瘤全抗原。将B16黑色素瘤抗原致敏DC细胞完成肿瘤全抗原的负载。将DC与T共同培养,诱导T细胞分化产生效应细胞CTL。并通过流氏细胞术检测DC细胞的免疫表型,确定DC细胞成熟活性。用MACS法分别于DC细胞与T细胞共同培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分,便得到培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞与培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞2组。另设未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组及对照组2组。 然后再将NMLD状态的B16黑色素瘤C57BL/6小鼠80只,按随机数字表法分为4组并经鼠尾静脉进行效应细胞DC-CTL回输。第1组:培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第2组:培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第3组:未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第四组:对照组。 采用MTT染色法检测4组的体外杀伤实验,观察效应细胞DC-CTL对B16黑色素瘤的杀伤效果。同时观察体内回输DC-CTL效应细胞后小鼠的生活习性、肿瘤的临床特征、DC-CTL细胞及靶细胞的超微结构与细胞增殖与凋亡特征等形态学表现。证实特异性抗原负载的DC-CTL细胞对肿瘤的杀伤效能。 最后,运用流氏细胞术(FACS)及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测人体内Treg细胞、TNF-α及IL-12含量变化,证实化疗药物的抗肿瘤机制及对机体免疫系统的影响。 结果:DC细胞诱导负载B16黑色素瘤肿瘤抗原的DC-CTL细胞活化时可见细胞增大、胞质丰富、活力良好。与肿瘤细胞接触后则诱导肿瘤细胞出现凋亡及胀亡表现,高效杀伤肿瘤细胞。培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组、培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组、未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组MTT法体外杀伤试验:三组效应细胞对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组和培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组对B16黑色素细胞的杀伤作用明显高于(P0.05)未删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组。且随效靶比升高杀伤作用增强。培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的DC-CTL组间比较对B16黑色素细胞的杀伤作用没有显著性差异(P 0.05)。 B16黑色素瘤的体内抑瘤试验三组实验组DC-CTL细胞均可使瘤体缩小。抑瘤率明显高于对照组(P0.05);2组删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组抑瘤率明显高于未删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL效应细胞组(P0.05),培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组间比较没有明显差异(P 0.05)。 流氏细胞术检测肿瘤细胞增殖周期的变化;3组实验组与对照组比较G0/G1期细胞比率、AI显著升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显著下降(P0.05);删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组G0/G1期细胞比率、AI明显高于未删除CD4~+CD25~+Treg组,G2/M期细胞比率、PI显著低于未删除CD4~+CD25~+Treg组,S期无明显变化(P0.05)。删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组之间比较G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和AI、PI均没有明显差异(P 0.05)。 化疗药物改变肿瘤患者体内Treg细胞、TNF-α及IL-12含量,三种指标不仅说明化疗药物对机体免疫机能有显著影响,而且还可以做为评估化疗效果的指标。 结论: 1、特异性抗原致敏的DC-CTL细胞对B16黑色素瘤细胞有较强的杀伤作用。特异性抗原致敏的DC-CTL细胞可以作用于肿瘤细胞的细胞周期,影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。充分说明DC-CTL细胞是一种具有强大肿瘤杀伤能力且具有肿瘤特异性的过继免疫治疗的效应细胞。 2、删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分后的特异性抗原致敏的DC-CTL细胞抗肿瘤免疫效应更具特异性与高效。说明CD4~+CD25~+Treg能够抑制具有肿瘤特异性的效应细胞DC-CTL。去除CD4~+CD25~+Treg细胞,重新募集效应性T细胞能够增强机体的抗肿瘤作用,必将成为一种可行的肿瘤免疫治疗方法。 3、不同时间删除CD4~+CD25~+Treg细胞后,从抑瘤作用、对肿瘤细胞细胞周期的影响和对肿瘤细胞的杀伤作用上都有一定的差异,但没有统计学意义,说明CD4~+CD25~+Treg细胞各个亚群的来源和作用机制还需要进一步的研究。 4、化疗药物改变机体内CD4~+CD25~+Treg、TNF-α及IL-12含量,对机体免疫系统有显著影响。同时也是评估化疗效果的指标。联合使用中药可以减轻其毒副作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 阎洪彦,王立顺;MUC1粘蛋白—肿瘤生物治疗的新靶点[J];国外医学.免疫学分册;2000年02期
2 韩卫宁,李德敏,苏丽,欧阳为明,贾卫,金伯泉;TLSF_(JM)对同种异体抗原诱导的小鼠杀伤性T细胞分化及效应功能的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;1999年02期
3 王洪军,金宁一,年春志,江文正,王继群,魏安明,吴益民;HIV-1env/IFNα-2b表达产物诱导的淋巴细胞转化与CTL实验[J];中国人兽共患病杂志;2004年02期
4 倪兵,吴玉章;DNA疫苗与CTL[J];第三军医大学学报;2000年10期
5 王立顺,李杰,朱迅;肿瘤源性CTL表位研究进展[J];免疫学杂志;2000年S1期
6 徐龙,马安伦,张冬青,郑志强,葛海良;MHC-I类分子在诱导异体肾癌特异性CTL中的作用[J];细胞与分子免疫学杂志;2001年02期
7 于鸿,张健,程颖,鲍慧铮,马丽霞,夏凤琴;抗原冲击致敏的脐血有核细胞体外诱导特异性CTL的实验研究[J];实用肿瘤学杂志;2001年04期
8 刘树人,施理,张宜俊,李灼亮;HBsAg对树突状细胞免疫表型及CTL杀伤活性的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2003年04期
9 汪涛,郭华章,王海涛,金伯泉;丙型肝炎特异性细胞毒性T细胞及其免疫应答的研究进展[J];细胞与分子免疫学杂志;1998年04期
10 韩彩芝,许顺江,刘京生,李兴琴,魏丽君;肿瘤细胞HSP-70多肽诱导CTL及其抗瘤作用机制的研究[J];河北医药;2002年03期
11 唐华,罗红艳,银平章,孔令非;荷瘤小鼠骨髓来源的树突状细胞诱导产生的抗肿瘤免疫反应[J];中国生物制品学杂志;2001年01期
12 邵莹,徐琪,李慧,李霈霈,安秀梅,张澎,和世岩,张乃宁,王殿昌,郝希山;MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体DC及激活CTL杀伤性的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1999年03期
13 王平平;王健;;趋化因子的表达与乙型肝炎[J];现代预防医学;2007年05期
14 杨曌;牛微;吴玉章;赵建平;赵树文;王莉;;含IL-15基因佐剂的肿瘤疫苗对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞功能的影响[J];现代肿瘤医学;2007年06期
15 顾宗江,张学光;转B7-1基因的人多发性骨髓瘤细胞XG-7在激发杀肿瘤细胞CTL中的作用[J];苏州医学院学报;1998年09期
16 唐华,曹雪涛,于益芝,朱学军,银平章,张明徽;抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实验研究[J];中国免疫学杂志;1999年10期
17 胡章勇,章廉,郭亚兵,冯筱榕,张明霞,文维群,骆抗先;拉米夫定对慢性乙型肝炎患者CTL活性的影响[J];免疫学杂志;2001年06期
18 石统东,王莉,贾正才,周伟,邹丽云;MART-1特异性治疗性多肽诱导CD8~+T细胞应答的研究[J];第三军医大学学报;2003年10期
19 陈吉泉,曹雪涛,修清玉,何龙,于益芝,罗文侗;IL-18基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞体内诱导的抗肿瘤免疫反应[J];中国免疫学杂志;2003年04期
20 汪泽厚,潘进勇,曾毅,刘素英;人工合成HLA衍生肽对CTL和NK细胞毒功能的影响[J];中国免疫学杂志;2001年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 梁声强;杜娟;詹林盛;;HBV病毒特异性CTL在病毒清除过程中的作用[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
2 徐然然;卫江波;郑秀玉;付志浩;饶春明;王军志;;基于CFSE和PI的流式细胞术测定CTL杀伤率方法的建立及优化[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 李荣;傅卫军;姜华;袁振刚;张春阳;奚昊;周莉莉;张文皓;侯健;;热休克蛋白表位肽诱导特异性CTL抗多发性骨髓瘤的实验研究[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
4 程浩;郑树;刘晓松;周健;;含HPV16 E7的嵌合型VLPs通过MHC-1通路得到呈递[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
5 王升志;赵军;吕运松;高向东;金慧军;毛祖彝;王大章;;热化疗对荷瘤鼠CTL细胞活性影响的研究[A];第五次全国口腔颌面—头颈肿瘤学术研讨会论文汇编[C];2006年
6 吕萍;徐军;;野生型P53基因修饰树突状细胞体外诱导免疫杀伤肺癌细胞[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
7 祝和成;吴尚辉;黄柏英;祝斌;顾焕华;罗学滨;;人DC与胰腺癌细胞融合体外诱导特异性抗胰腺癌CTL[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
8 张辉;董荣胜;高西;;一种嵌入式系统扩展流关系Petri网及应用[A];广西计算机学会2007年年会论文集[C];2007年
9 单保恩;郝京生;;IL-23的抗肿瘤作用及对小鼠脾细胞免疫功能的影响[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
10 单保恩;郝京生;;IL-23的抗肿瘤作用及对小鼠脾细胞免疫功能的影响[A];河北省免疫学会第5次会员代表暨学术大会论文摘要集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张燕;肿瘤免疫治疗中CTL细胞、Treg细胞及其相关性研究[D];河北医科大学;2010年
2 赵月莹;白血病NASCT患者CTL克隆细胞的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年
3 孙伟;过继单一pMHC特异性的同种CTL清除体内特定性状的靶细胞[D];华中科技大学;2010年
4 赵胜梅;淋巴细胞MHC-I在乳腺癌患者中的表达变化及其对CTL功能的影响[D];山东大学;2010年
5 汤旭东;肝素酶不同CTL表位混合多肽疫苗抗肿瘤效应的实验研究[D];第三军医大学;2011年
6 王冰;EB病毒潜伏膜蛋白2A特异性CTL表位筛选及免疫功能研究[D];南京医科大学;2009年
7 黄德东;中国人群HIV-1 Gag区特异性CTL应答和免疫逃逸[D];第四军医大学;2010年
8 马杰;人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究[D];吉林大学;2005年
9 向泽敏;热休克蛋白65-HER2多表位融合蛋白的构建及其生物学功能研究[D];吉林大学;2006年
10 练诗梅;人脐血来源树突状细胞的体外诱导、扩增、鉴定及抗白血病作用研究[D];大连医科大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡凤霞;乙肝相关慢加亚急性肝衰竭患者外周血Th17、Treg及CTL细胞的变化及临床意义的初步探讨[D];苏州大学;2012年
2 包红菊;抗PD-L1单抗联合CTL对肺癌免疫治疗的实验研究[D];苏州大学;2010年
3 周学智;NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL杀伤视网膜母细胞瘤细胞株作用的研究[D];重庆医科大学;2012年
4 朱成英;重组腺相关病毒携带CEA感染DC诱导CTL抗lovo直肠癌细胞活性的研究[D];山西医科大学;2012年
5 赵金华;EWS-FLI1融合区与HLA-A*0201限制性CTL表位的实验研究[D];南昌大学;2010年
6 王国珍;肝素酶CTL表位多抗原肽(MAP)疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究[D];第三军医大学;2011年
7 赵稳;HIV-1抗原特异性CTL免疫应答影响因素的研究[D];广州医学院;2010年
8 刘颖;不同疫苗佐剂对OVA诱生CTL免疫应答的影响[D];西北农林科技大学;2011年
9 王美菊;促进蛋白抗原诱生CD8~+ CTL反应的疫苗佐剂的研究[D];西北农林科技大学;2012年
10 廖忠莉;人端粒酶逆转录酶CTL表位多抗原肽(MAP)疫苗的设计及其抗肿瘤活性研究[D];第三军医大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 蔡云锦 本报实习记者 董军 唐秀艳 郭澄宇;呼叫中心CTL革命的火把[N];中国经营报;2000年
2 小丽;如何防止网站被黑[N];江苏经济报;2000年
3 ;国际域名你抢注了吗[N];中国计算机报;2000年
4 网;TNT跨入台湾仓储物流市场[N];国际经贸消息;2000年
5 保健时报记者 黄馨;β受体功能亢进症有药可医[N];保健时报;2007年
6 曲日胜 张启军;肿瘤过继免疫疗法进入临床[N];健康报;2006年
7 第四军医大学全军基因诊断研究所博士 张菊吴一福;主动免疫祛除乳头状瘤病毒[N];健康报;2007年
8 原驰 晓彦;吉林大学恶性肿瘤临床研究达国际先进水平[N];吉林日报;2006年
9 记者  毛黎;艾滋病病毒破坏免疫系统机理查明[N];科技日报;2006年
10 ;海水中怎样找到胡萝卜素?(下)[N];科技日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978