他汀类药物对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用及其信号转导通路研究

【摘要】： 慢性充血性心力衰竭(CHF)是各种心脏疾病发展的终末阶段,其发病率和病死率随着全球老龄化的不断加剧逐年增多。目前虽有多种药物可改善心衰患者症状,但真正能够阻断甚至逆转心衰进程的疗法或药物尚未问世。因此,关于心衰的发病机制和治疗的研究仍在不断深入。 他汀类药物是临床上应用广泛的降脂药,有研究表明,他汀对心衰患者可能有益。本研究以培养的新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)为研究对象,采用比色法、流式细胞术、Western Blot和细胞免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描技术等实验方法,观察了醛固酮(Ald)诱导的心脏成纤维细胞增殖、DNA合成、胶原合成及细胞周期变化,及可能的分子机制;同时观察HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀(Ato)对Ald诱导的心脏成纤维细胞增殖、DNA合成、胶原合成及细胞周期变化的影响及其可能的分子机制;还应用比色法和形态学观察、流式细胞术等凋亡检测方法,分别测定了Ato和瑞舒伐他汀(Ros)对CFs增殖和凋亡的影响;并对脂溶性的Ato和水溶性的Ros对心肌成纤维的抑制作用进行了比较。为阐明心肌纤维化的发生机制,防治心肌纤维化提供实验依据。实验内容主要包括以下五部分: 第一部分醛固酮对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的促进作用及其信号转导通路 目的:研究Ald对SD乳鼠CFs增殖和胶原合成的促进作用及其作用机制。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入螺内酯(Spi)干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,流式细胞术检测CFs细胞周期,羟脯氨酸试剂盒检测CFs胶原合成,免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜扫描半定量p-ERK1/2、p-AKT、Cyclin D1、Cyclin E2的表达变化。 结果:1. Ald和Spi对CFs增殖的影响:MTT结果表明,与对照组比较,10~(-9) mol/L～10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值均显著升高(P 0.05,P 0.05,P 0.01)。10~(-10) mol/L Ald组的平均吸光度值与对照组比较没有显著差异。10~(-9) mol/L～10~(-7)mol/L Ald组同时给予10~(-6 mol/L Spi,平均吸光度值均明显低于相应Ald组(P 0.05,P 0.05,P 0.01),而与对照组比较没有显著差异。10~(-10) mol/L与10~(-9) mol/L、10~(-9) mol/L与10~(-8) mol/L、10~(-8) mol/L与10~(-7) mol/L之间均无显著差异。10~(-10) mol/L Ald组同时给予10~(-6) mol/L Spi,平均吸光度值无显著变化,与对照组比较也无显著差异。 2. Ald和Spi对CFs DNA合成的影响:Brdu结果表明,与对照组比较,10~(-9) mol/L～10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值均显著升高(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。10~(-9mol/L～10~(-7) mol/L Ald组同时给予10~(-6mol/L Spi,平均吸光度值均明显低于相应Ald组(P 0.01,P 0.01,P 0.01),而与对照组比较没有显著差异。10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值明显高于10~(-8) mol/L Ald组(P 0.05),10~(-8) mol/L与10~(-9) mol/L Ald组间吸光度值没有显著差异。 3. Ald和Spi对CFs细胞周期的影响:采用流式细胞术对CFs细胞周期进行分析,结果表明:1)G1期细胞百分比:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h的G1期细胞百分比均显著减少( P 0.01,P 0.01,P 0.01)。同时给予10~(-6) mol/L Spi组的G1期细胞百分比均明显高于相应Ald组(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。10~(-7 mol/LAld作用48 h组的G1期细胞百分比明显低于24 h组(P 0.01),10~(-7mol/LAld作用72 h组的G1期细胞百分比明显低于48 h组(P 0.01)。 2)S期细胞百分比:与对照组比较, 10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h的S期细胞百分比均显著增加(P 0.01, P 0.01, P 0.01)。同时给予10~(-6) mol/L Spi组的S期细胞百分比均明显低于相应Ald组(P 0.01, P 0.01, P 0.01)。10~(-7mol/LAld作用48 h组的S期细胞百分比明显高于24h组(P 0.01),10~(-7mol/LAld作用72 h组的S期细胞百分比明显高于48 h组(P 0.01)。 3)PI:与对照组比较, 10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h的PI均显著增加(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。同时给予10~(-6) mol/L Spi组的PI均明显低于相应Ald组(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。10~(-7) mol/LAld作用48 h组的PI明显高于24 h组(P 0.01),10~(-7mol/LAld作用72 h组的PI明显高于48 h组(P 0.01)。 4. Ald和Spi对CFs胶原合成的影响:羟脯氨酸的量能反映胶原代谢情况。羟脯氨酸含量测定表明:与对照组比较,相应时间点的10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值均显著升高(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald刺激组比较,相应时间点的10~(-7) mol /L Ald+ 10~(-6) mol/L Spi组的平均吸光度值均显著降低(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。对照组与相应时间点的10~(-7) mol/L Ald+10~(-6) mol/L Spi组比较均有显著差异(P 0.01,P 0.01,P 0.01),即10~(-6) mol/L Spi不能完全逆转10~(-7) mol /L Ald的促胶原合成作用。10~(-7) mol/L Ald 48 h组与10~(-7mol/L Ald 24 h组比较,10~(-7) mol/L Ald 72 h组与10~(-7) mol/L Ald 48 h组比较,平均吸光度值均显著升高(P 0.01, P 0.01),即随时间延长,Ald刺激的胶原合成显著增加。 5. Ald对CFs周期蛋白Cycin D1表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 24 h、48 h均可明显上调CFs胞核内的Cycin D1表达(P 0.01,P 0.05),且Ald作用24 h时Cycin D1表达上调较48 h更为显著(P 0.01)。 6. Ald对CFs周期蛋白Cyclin E2表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 24 h、48 h、72 h均可明显上调CFs胞核内的Cycin E2表达(P 0.01,P 0.05,P 0.05),且Ald作用24 h时Cycin E2表达上调较48 h、72 h更为显著(P 0.01,P 0.01)。 7. Ald对CFs周期蛋白P-ERK1/2表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 5 min、15 min、30 min、45min、60 min、2 h、4 h、8 h、24 h均可明显上调P-ERK1/2表达(P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.05),且在Ald刺激30 min和4 h时P-ERK1/2表达量2次达峰。 8. Ald对CFs周期蛋白p-AKT表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 45 min、60 min、2 h均可明显上调P-AKT表达(P 0.01,P 0.01,P 0.01),但无明显峰值。(见Fig. 1-6) 结论:外源性Ald可诱导CFs增殖、DNA合成和胶原合成,发挥其致心肌纤维化作用,此作用与其通过ERK1/2和Akt通路上调周期蛋白Cycin D1和Cyclin E2表达有关。 第二部分阿托伐他汀对醛固酮诱导的SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的抑制作用及其机制探讨 目的:研究Ato对Ald诱导的SD乳鼠CFs增殖和胶原合成的抑制作用及其作用的分子机制。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入Ato干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,流式细胞术检测CFs周期,羟脯氨酸试剂盒检测CFs胶原合成,免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜扫描和Western Blot半定量p-ERK1/2、p-AKT、Cyclin D1、Cyclin E2的表达变化。 结果:1. Ato对Ald诱导的CFs增殖的影响:与对照组比较, 10~(-7 mol/L Ald组的平均吸光度值显著升高( P 0.01),10~(-7) mol/L Ald+10~(-6 mol/L Spi、10~(-8) mol/L、10~(-7) mol/L Ato组无显著差异。10~(-7) mol/L Ald +10~(-6) mol/L、10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著低于对照组(P 0.01,P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,同时给予10~(-6) mol/L Spi、10~(-8) mol/L～10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01)。 2. Ato对Ald诱导的CFs DNA合成的影响:与对照组比较,10~(-7 mol/L Ald组的平均吸光度值显著升高(P 0.01),10~(-7) mol/L Ald+10~(-6mol/L Spi、10~(-8) mol/L、10~(-7) mol/L Ato组无显著差异。10~(-7) mol/L Ald +10~(-6) mol/L、10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著低于对照组(P 0.01,P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,同时给予10~(-6) mol/L Spi、10~(-8) mol/L～10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01)。 3. Ato对Ald诱导的CFs细胞周期的影响:1)对各组各时间段的G1期细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h均能明显降低G1期细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato、10~(-6 mol/L Spi+10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h,G1期细胞均明显增多(均P 0.01)。 2)对各组各时间段的S期细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h均能明显增加S期细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato、10~(-6) mol/L Spi+10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h,S期细胞均明显较少(均P 0.01)。 3)对各组各时间段的PI进行统计学分析,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h均能明显增加PI(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato、10~(-6) mol/L Spi +10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h, PI均明显降低(均P 0.01)。 4. Ato和Ald对CFs凋亡的影响:流式细胞术检测亚二倍体峰,结果显示,与对照组比较,10~(-6、10~(-5) mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h组凋亡细胞比例显著增加(均P 0.01)。10~(-6、10~(-5mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 48 h组凋亡细胞比例分别较对应的10~(-6、10~(-5) mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 24 h组显著增加(P 0.01,P 0.01),10~(-6、10~(-5 mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 72 h组凋亡细胞比例分别较对应的10~(-6、10~(-5 mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 48 h组显著增加(P 0.01,P 0.01)。 5. Ato对Ald诱导的CFs胶原合成的影响:对各组各时间段培养基中的羟脯氨酸含量进行测定,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h,平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,同时给予10~(-6) mol/L Spi、10~(-8～10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01)。 6. Ato对Ald诱导的CFs周期蛋白Cyclin D1表达的影响:10~(-5 mol/L Ato可明显抑制10~(-7) mol/L Ald上调的Cyclin D1的表达(P 0.01)。 7. Ato对Ald诱导的CFs周期蛋白Cyclin E2表达的影响:10~(-5 mol/L Ato可明显抑制10~(-7) mol/L Ald上调的Cyclin E2的表达(P 0.01)。 8. Ato对Ald诱导的CFs p-ERK1/2表达的影响:1)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 30 min同时给予10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato进行干预,免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描结果表明,各浓度Ato均不能抑制P-ERK1/2表达。 2)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 4 h同时给予10~(-7)～10~(-5mol/L Ato进行干预,免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描结果表明,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-ERK1/2表达(均P 0.01)。10~(-6) mol/L较10~(-7) mol/L Ato对P-ERK1/2表达的抑制作用更强(P 0.01)。 3)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 4 h同时给予不同浓度Ato进行干预,Western结果表明,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-ERK1/2表达(均P 0.01)。 9. Ato对Ald诱导的CFs P-AKT表达的的影响:1)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 1 h同时给予不同浓度Ato进行干预,免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描结果表明,10~(-7 ~10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-AKT表达(均P 0.01)。10~(-6) mol/L与10~(-7) mol/L Ato比较,10~(-5) mol/L与10~(-6) mol/L Ato比较,对P-AKT表达的抑制作用均有显著差异(P 0.01,P 0.01)。 2)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 1 h同时给予不同浓度Ato进行干预,Western结果表明,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-AKT表达(均P 0.01)。 结论:Ato可明显抑制Ald诱导的CFs增殖、DNA合成和胶原合成,抑制Ald的致心肌纤维化作用,此作用与其通过抑制ERK1/2和Akt通路,进而抑制周期蛋白Cycin D1和Cyclin E2表达有关。 第三部分阿托伐他汀对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和对凋亡的诱导作用 目的:研究Ato对SD乳鼠CFs增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,并加入Ato干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,倒置生物显微镜和荧光显微镜检测凋亡细胞形态,流式细胞术检测CFs凋亡率。 结果:1. Ato对CFs增殖的影响:与对照组比较,10~(-7) mol/L～10~(-5 mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ato对CFs增殖的抑制作用。与Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5mol/L FPP,10~(-7) mol/L～10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。 2. Ato对CFs DNA合成的影响:与对照组比较,10~(-7) mol/L～10~(-5 mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ato对CFs DNA合成的抑制作用。与Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5) mol/L FPP,10~(-7) mol/L～10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。 3. Ato对CFs的形态学影响:1)倒置生物显微镜观察不同浓度Ato对CFs的影响,可见未加Ato处理组的CFs细胞间隙小且贴壁良好,几乎没有脱壁漂浮的圆形死细胞。Ato处理后,部分细胞胞质回缩,细胞间间隙增大,细胞贴壁能力不同程度减弱,随Ato浓度增大,处理时间延长,细胞形态改变越来越明显。 2)采用瑞氏—吉姆萨染色法,对空白组和各处理组细胞进行染色后,倒置生物显微镜下观察,可见未加Ato处理组的CFs呈梭形、三角形、多边形,胞浆着色均匀,淡粉红色,胞核较大呈深粉色或淡紫色,细胞贴壁良好,细胞间隙很小。Ato处理后,CFs出现了不同程度的胞质回缩、变形,核固缩、深染,细胞间隙增大等一系列改变。随Ato浓度增大,处理时间延长,细胞的变化越发显著。 3)Hochest33258染色后,荧光显微镜下进行观察,可见未加Ato处理组的CFs胞核形状规则,呈椭圆形,着色较浅,呈淡蓝色荧光。Ato处理后,胞核出现不同程度固缩、变形、甚至崩解为大小不一的碎片,着色较深,呈深蓝色。 4. AnexinV/PI双染,流式细胞术检测Ato对CFs凋亡的影响:1)对不同浓度Ato处理组各时间段早期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加早期凋亡细胞百分比(均P 0.01)。对相同浓度Ato作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ato作用后的早期凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示除10~(-7) mol/L与10~(-6) mol/L Ato间作用24 h和72 h无显著差异外,Ato可时间、剂量依赖性的增加早期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 2)对不同浓度Ato处理组各时间段晚期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加晚期凋亡细胞百分比(均P 0.01)。对相同浓度Ato作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ato作用后的晚期凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示除10~(-7) mol/L Ato作用24 h和48 h之间、10~(-6) mol/L Ato作用24 h和48 h之间无显著差异外, Ato可时间、剂量依赖性的增加晚期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 3)对不同浓度Ato处理组各时间段总凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加总凋亡细胞百分比(均P 0.01)。对相同浓度Ato作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ato作用后的凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示Ato可时间、剂量依赖性的增加凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 5. PI单染,流式细胞术检测亚二倍体峰:与相应对照组比较,10~(-7)～10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加凋亡细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-5) mol/L Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5 mol/L FPP在24 h、48 h和72 h均能部分逆转Ato对CFs的凋亡诱导作用(均P 0.01)。 结论:10~(-7)～10~(-5mol/L Ato不仅可抑制CFs增殖和DNA合成,还可时间和剂量依赖性的诱导CFs凋亡。 第四部分瑞舒伐他汀对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和对凋亡的诱导作用 目的:研究Ros对SD乳鼠CFs增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,并加入Ros干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,倒置生物显微镜和荧光显微镜检测凋亡细胞形态,流式细胞术检测CFs凋亡率。 结果:1. Ros对CFs增殖的影响:与对照组比较,10~(-8) mol/L～10~(-5 mol/L Ros组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ros组的平均吸光度值显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ros对CFs增殖的抑制作用。与Ros单独作用组比较,同时给予10~(-5) mol/L FPP,10~(-8) mol/L～10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著升高(P 0.05,P 0.01,P 0.01, P 0.01)。 2. Ros对CFs DNA合成的影响:与对照组比较,10~(-7) mol/L～10~(-5 mol/L Ros组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ros组的平均吸光度值显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ros对CFs DNA合成的抑制作用。与Ros单独作用组比较,同时给予10~(-5) mol/L FPP, 10~(-7) mol/L～10~(-5) mol/L Ros组的平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。 3. Ros对CFs的形态学影响:1)倒置生物显微镜观察不同浓度Ros对CFs的影响,可见未加Ros处理组的CFs细胞间隙小且贴壁良好,几乎没有脱壁漂浮的圆形死细胞。Ros处理后,部分细胞胞质回缩,细胞间间隙增大,细胞贴壁能力不同程度减弱,随Ros浓度增大,处理时间延长,细胞形态改变越来越明显。 2)采用瑞氏—吉姆萨染色法,对空白组和各处理组细胞进行染色后,倒置生物显微镜下观察,可见未加Ros处理组的CFs呈梭形、三角形、多边形,胞浆着色均匀,淡粉红色,胞核较大呈深粉色或淡紫色,细胞贴壁良好,细胞间隙很小。Ros处理后,CFs出现了不同程度的胞质回缩、变形,核固缩、深染,细胞间隙增大等一系列改变。随Ros浓度增大,处理时间延长,细胞的变化越发显著。 3)Hochest33258染色后,荧光显微镜下进行观察,可见未加Ros处理组的CFs胞核形状规则,呈椭圆形,着色较浅,呈淡蓝色荧光。Ros处理后,胞核出现不同程度固缩、变形、甚至崩解为大小不一的碎片,着色较深,呈深蓝色。 4. AnexinV/PI双染,流式细胞术检测Ros对CFs凋亡的影响:1)对不同浓度Ros处理组各时间段早期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,除10~(-7) mol/L Ros作用24 h外,10~(-7) mol/L Ros作用48 h、72 h ,10~(-6、10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72 h均能明显增加早期凋亡细胞百分比(均P 0.05)。对相同浓度Ros作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ros作用后的早期凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示Ros可时间、剂量依赖性的增加早期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 2)对不同浓度Ros处理组各时间段晚期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,除10~(-7) mol/L Ros作用24 h外,10~(-7) mol/L Ros作用48 h、72 h ,10~(-6、10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72 h均能明显增加晚期凋亡细胞百分比(均P 0.05)。对相同浓度Ros作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ros作用后的晚期凋亡细胞百分比分别进行比较,Ros可时间、剂量依赖性的增加晚期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 3)对不同浓度Ros处理组各时间段总凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7～10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72 h均能明显增加总凋亡细胞百分比(均P 0.05)。对相同浓度Ros作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ros作用后的凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示Ros可时间、剂量依赖性的增加凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 5. PI单染,流式细胞术检测亚二倍体峰:与相应对照组比较,10~(-7～10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72h均能明显增加凋亡细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-5) mol/L Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5 mol/L FPP在24 h、48 h和72 h均能部分逆转Ros对CFs的凋亡诱导作用(均P 0.01)。 结论:10~(-7～10~(-5mol/L Ros不仅可抑制CFs增殖和DNA合成,还可以时间和剂量依赖性的诱导CFs凋亡。 第五部分阿托伐他汀和瑞舒伐他汀对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖抑制作用比较 目的:比较Ato和Ros对SD乳鼠CFs增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,并加入Ato或Ros干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,流式细胞术检测CFs细胞周期,羟脯氨酸试剂盒检测CFs胶原合成,流式细胞术检测CFs凋亡。 结果:1. CFs增殖测定:对MTT测定结果进行统计分析显示,与空白对照组相比,Ros和Ato 10~(-7～10~(-5) mol/L均可抑制新生大鼠CFs增殖(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs增殖的抑制效果无显著差异。 2. CFs DNA合成测定:对Brdu测定结果进行统计分析显示,与空白对照组相比,Ros和Ato 10~(-7～10~(-5) mol/L组均可抑制新生大鼠CFs DNA合成(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs DNA合成的抑制效果无显著差异。 3. CFs细胞周期测定:流式细胞术检测细胞周期,结果显示,与空白对照组比较,Ros和Ato 10~(-7～10~(-5) mol/L组作用24 h均可增加CFs处于G0/G1期的百分率,降低CFs处于S期的百分率,并降低细胞增殖指数(PI)(均P 0.05)。Ros和Ato各相同剂量组间,处于G0/G1期、G2/M期和S期的CFs比例及PI均无显著差异,即2药对细胞周期的阻滞作用相似。 4.流式细胞术检测亚二倍体峰:流式细胞术检测亚二倍体峰,可反应每个处理组中晚期凋亡细胞所占比率,结果显示,10~(-7～10~(-5mol/L Ato和Ros均可诱导CFs凋亡(均P 0.01),且2药均有明显的剂量依赖,随药物浓度增加,凋亡细胞比率随之增加(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs凋亡的促进效果无显著差异。 5. CFs胶原分泌测定:羟脯氨酸测定结果显示,Ros和Ato 10~(-7～10~(-5) mol/L组均可抑制新生大鼠CFs胶原分泌(均P 0.01)。Ros对CFs胶原分泌的抑制作用呈明显的剂量依赖,随Ros浓度增加,作用逐渐增强(均P 0.01)。10~(-7与10~(-6) mol/L Ato间对胶原分泌的抑制作用无显著差异,10~(-6与10~(-5) mol/L Ato间在各时间点对胶原分泌的抑制作用差异显著(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs胶原合成的抑制效果无显著差异。 结论:Ros与Ato对SD乳鼠CFs增殖和DNA合成及胶原合成的抑制作用无明显差异。Ros与Ato对乳鼠CFs凋亡的诱导作用无明显差异。