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补肾法、疏肝法对排卵障碍模型大鼠卵巢细胞因子影响的比较研究

路帅  
【摘要】: 目的:探讨补肾调经方、逍遥丸治疗排卵障碍性疾病的作用机理,通过雷公藤、雄激素致排卵障碍模型大鼠卵巢细胞因子的变化研究排卵障碍的发生与细胞因子的关系,比较补肾调经方与逍遥丸对细胞因子在卵巢中表达的影响,为补肾调经方与逍遥丸中药促使卵泡发育及排卵的临床应用提供实验依据,从而促进中医妇科治疗学的发展。 方法:选用3月龄健康雌性Wistar大鼠204只,体重180~250g。随机取170只大鼠改进郑家润,梁文波等方法。雷公藤多甙片35mg/kg/d(给药剂量为临床成人用量的20倍),灌胃法给药,连续57天。造模组连续阴道上皮细胞涂片两个性周期(一个性周期4~5天),动情周期转为不规则,主要为周期不完整及周期延长,提示雷公藤致排卵障碍大鼠模型造模成功。其余34只灌胃给蒸馏水作为正常对照组。 选用同批出生9日龄健康雌性SD大鼠204只,体重约15g。随机取170只大鼠参照俞瑾等方法,于颈背部皮下一次性注射丙酸睾丸酮1.25mg/只(0.05ml/只)造模。第22日龄断奶,自由进食,同样条件饲养。第70日龄阴道开口,造模组大鼠连续阴道上皮细胞涂片两个性周期,阴道上皮细胞持续角化,提示雄激素致排卵障碍大鼠模型造模成功。其余34只于颈背部皮下一次性注射中性茶油0.05ml/只作为正常对照组。 将雷公藤、雄激素致排卵障碍成模大鼠分别随机分为模型组和治疗组,治疗组包括:补肾调经方高剂量组、补肾调经方低剂量组、逍遥丸高剂量组、逍遥丸低剂量组,每组34只;治疗组分别灌服补肾调经方与逍遥丸,模型组和正常组灌服蒸馏水,每日1次。灌胃给药5周,并阴道细胞涂片两个性周期。最后一次给药后禁食8小时,各组分别选择动情前期与动情后期断头处死,无菌操作剖腹取出左侧卵巢组织,吸去血迹,称重后置于4%多聚甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋,5μm厚连续切片,进行免疫组织化学染色,观察卵巢形态学变化和组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转化生长因子-β1受体(TGF-βR1)的蛋白表达。速取右侧卵巢组织置于DEPC水处理的冻存管中放于液氮冻存,采用实时荧光定量PCR法检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1 mRNA的表达量。 结果: 1补肾调经方对两种排卵障碍模型大鼠卵巢细胞因子的影响 1.1卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1的蛋白表达两种排卵障碍模型大鼠中,在动情前、后期,与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞及卵母细胞中IL-1β表达均增强(均P0.01);卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α表达均增强(均P0.01);颗粒细胞及间质细胞中TGF-β1和TGF-βR1表达均增强(均P0.01)。 雷公藤致排卵障碍模型大鼠灌服补肾调经方后,与模型组比较,补肾高、低剂量组在动情前后期,大鼠卵巢颗粒细胞及卵母细胞中IL-1β表达均降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05);卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α的表达均降低(均P0.01),在动情前期,补肾高、低剂量组均尚未达到正常(均P0.01),在动情后期,补肾低剂量组接近正常(P0.05);卵巢颗粒细胞及间质细胞TGF-β1表达均降低(均P0.01),但均尚未达到正常(均P0.01);卵巢颗粒细胞及间质细胞TGF-βR1表达均降低(均P 0.01),并接近正常(均P0.05)。 雄激素致排卵障碍模型大鼠灌服补肾调经方后,与模型组比较,补肾高、低剂量组大鼠卵巢颗粒细胞及卵母细胞IL-1β表达均降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05);卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α表达均降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05);卵巢颗粒细胞及间质细胞TGF-β1、TGF-βR1表达降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05)。 1.2卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1 mRNA的表达量两种排卵障碍模型大鼠中,在动情前、后期,与正常组比较,模型组卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA的表达量均升高(均P0.01)。 雷公藤致排卵障碍模型大鼠灌服补肾调经方后,与模型组比较,补肾高、低剂量组大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1 mRNA表达量均降低(均P0.01),其中,在动情前后期,补肾高、低剂量组卵巢组织中IL-1β、TGF-βR1mRNA的表达量、动情后期补肾低剂量组卵巢组织中TNF-α、TGF-β1的表达量接近正常(均P0.05)。 雄激素致排卵障碍模型大鼠灌服补肾调经方后,与模型组比较,补肾高、低剂量组大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA表达量降低(均P0.01),与正常组之间差别无统计学意义(均P0.05)。 2逍遥丸对两排卵障碍模型大鼠细胞因子的影响 2.1卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1的蛋白表达两种排卵障碍模型大鼠中,在动情前、后期,与正常组比较,两种模型组卵巢颗粒细胞及卵母细胞中IL-1β表达均增强(均P0.01);卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α表达均增强(均P0.01);卵巢颗粒细胞及间质细胞中TGF-β1和TGF-βR1表达均增强(均P0.01)。 雷公藤致排卵障碍模型大鼠灌服逍遥丸后,与模型组比较,逍遥高、低剂量组在动情前后期,大鼠卵巢颗粒细胞及卵母细胞IL-1β表达均降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05);卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α的表达均降低(均P0.01),在动情前、后期,逍遥高剂量组接近正常,逍遥低剂量尚未达到正常(均P0.01);卵巢颗粒细胞及间质细胞TGF-β1、TGF-βR1表达均降低(均P0.01),其中,在动情前期逍遥低剂量组尚未达到正常(P0.05或P0.01)。 雄激素致排卵障碍模型大鼠灌服逍遥丸后,与模型组比较,逍遥高、低剂量组大鼠卵巢颗粒细胞及卵母细胞IL-1β表达均降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05);卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α表达降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05);卵巢颗粒细胞及间质细胞TGF-β1、TGF-βR1表达降低(均P0.01),并接近正常(均P0.05)。 2.2卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA的表达量两种排卵障碍模型大鼠中,在动情前、后期,与正常组比较,模型组卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA的表达量均升高(均P0.01)。 雷公藤致排卵障碍模型大鼠灌服逍遥丸后,与模型组比较,逍遥高、低剂量组大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA表达量均降低(均P0.01),其中,在动情前后期,逍遥低剂量组卵巢组织中TNF-αmRNA的表达量、动情前期逍遥低剂量组卵巢组织中TGF-β1、TGF-βRmRNA的表达量,尚未达到正常(均P0.01)。 雄激素致排卵障碍模型大鼠灌服逍遥丸后,与模型组比较,逍遥高、低剂量组大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA表达量降低(均P0.01),与正常组之间差别无统计学意义(均P0.05)。 3补肾调经方与逍遥丸对两排卵障碍模型大鼠细胞因子影响的比较 3.1卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1的蛋白表达 雷公藤致排卵功能障碍模型大鼠中,卵巢颗粒细胞及卵母细胞中IL-1β在补肾高剂量组、补肾低剂量组、逍遥高剂量组、逍遥低剂量组之间的表达无明显差异(均P0.05);卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α的表达,在动情前期,补肾高剂量组高于补肾低剂量组与逍遥高、低剂量组(均P0.05),补肾低剂量与逍遥低剂量组高于逍遥高剂量组(P0.05;P0.01);动情后期,补肾高剂量高于补肾低剂量与逍遥高剂量组(均P0.01),逍遥低剂量高于补肾低剂量与逍遥高剂量组(均P0.01);卵巢颗粒细胞及间质细胞中TGF-β1的表达,在动情前后期,补肾高剂量组高于补肾低剂量组与逍遥高、低剂量组(均P0.01),补肾低剂量与逍遥低剂量组高于逍遥高剂量组(均P0.01);卵巢颗粒细胞及间质细胞中TGF-βR1的表达,在动情前期,逍遥高剂量组与补肾高、低剂量组之间均无差别(均P0.05),低于逍遥低剂量组的表达(均P0.01);在动情后期,补肾高、低剂量与逍遥高、低剂量间的表达无明显差异(均P0.05)。 雄激素致排卵障碍模型大鼠中,在动情前、后期,补肾高剂量组、补肾低剂量组、逍遥高剂量组、逍遥低剂量之间,卵巢颗粒细胞及卵母细胞中IL-1β的表达、卵巢卵母细胞及间质、黄体中巨噬样细胞TNF-α的表达、卵巢颗粒细胞及间质细胞中TGF-β1和TGF-βR1的表达均无明显差异(均P0.05)。 3.2卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA的表达量 雷公藤致排卵功能障碍模型大鼠卵巢组织中IL-1βmRNA在补肾高剂量组、补肾低剂量组、逍遥高剂量组、逍遥低剂量组之间的表达无明显差异(均P0.05);卵巢组织中TNF-αmRNA的表达量,在动情前期,补肾高剂量组高于补肾低剂量组与逍遥高、低剂量组(均P0.01),补肾低剂量与逍遥低剂量组高于逍遥高剂量组(均P0.01);动情后期,补肾高剂量高于补肾低剂量与逍遥高剂量组(均P0.01),逍遥低剂量高于补肾低剂量与逍遥高剂量组(均P0.01);卵巢组织中TGF-β1mRNA的表达量,在动情前期,补肾高剂量组高于补肾低剂量组与逍遥高、低剂量组(均P0.01),补肾低剂量与逍遥低剂量组高于逍遥高剂量组(均P0.01),在动情后期,逍遥高、低剂量与补肾低剂量组之间无明显差别(均P0.01),低于补肾高剂量组的表达(均P0.01);卵巢组织中TGF-βR1mRNA的表达量,在动情前期,逍遥高剂量组与补肾高、低剂量组之间均无差别(均P0.05),低于逍遥低剂量组的表达(均P0.01);在动情后期,补肾高、低剂量与逍遥高、低剂量间的表达无明显差异(均P0.05)。 雄激素致排卵障碍模型大鼠中,在动情前、后期,补肾高剂量组、补肾低剂量组、逍遥高剂量组、逍遥低剂量组之间,卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、TGF-βR1mRNA的表达量均无明显差异(均P0.05)。 结论: 1雷公藤、雄激素致排卵障碍模型大鼠中,模型组大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1及TGF-βR1蛋白和基因的水平较正常组均显著升高。说明IL-1β、TNF-α、TGF-β1及TGF-βR1与排卵功能密切相关。 2补肾调经方、逍遥丸均能显著降低排卵障碍模型大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1及TGF-βR1蛋白和基因的高表达。从而保持卵巢内环境稳定,使颗粒细胞增殖,卵母细胞成熟,进而促进了卵泡的发育、成熟。 3逍遥丸调节雷公藤致排卵障碍模型大鼠卵巢组织中TNF-α、TGF-β1及TGF-βR1蛋白和基因作用优于补肾调经方。补肾调经方与逍遥丸在调节雄激素致排卵障碍模型大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1及TGF-βR1蛋白和基因的作用均无差别。


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