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马鞭草质量控制与黄酮类成分的药代动力学研究

段坤峰  
【摘要】: 马鞭草为马鞭草科(Verbenaceae)植物马鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分,具有活血散瘀,截疟,解毒,利水消肿的功效。《Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals》记载,在民间该药常常被用作利尿药、祛痰药和抗风湿药,在西班牙的Navarra地区,该药广泛用于抗炎。桂承会等于1985年报道马鞭草水煎剂有一定镇咳作用,并证明马鞭草苷的镇咳作用与水煎剂基本一致。一般而言,中药发挥药效作用的物质基础多为一类或几类物质成分,马鞭草苷为马鞭草所含成分之一,与其同类或其它类的成分还有很多。本研究在总结前人工作的基础之上,对其质量标准及药代动力学方面做了进一步研究,为马鞭草的合理应用做出了有意义的探讨。 本文通过研究马鞭草提取液,在已知药效物质基础的前题下,对马鞭草药材指纹图谱、主要活性物质的含量测定以及有效成分在动物体内的吸收等情况进行了探讨,为马鞭草的开发利用奠定了基础。 第一部分不同产地马鞭草药材指纹图谱研究 目的:研究并建立不同产地马鞭草药材的指纹图谱,为科学评价与有效控制马鞭草药材质量提供新的方法。 方法:不同产地马鞭草药材的指纹图谱研究,色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈-0.05%磷酸水进行梯度洗脱,柱温为30℃;检测波长为265 nm,流速1.0 mL/min。 结果:建立了不同产地马鞭草药材HPLC-PDA指纹图谱共有模式,标定20个共有峰。并对12批不同产地马鞭草药材进行了相似度比较,8批马鞭草药材的相似度均在0.9以上,4批马鞭草药材相似度在0.8~0.9之间。 结论:本方法操作简便、快速、准确,可作为马鞭草药材的鉴别和质量控制方法。 第二部分马鞭草中主要糖苷和黄酮苷元的含量测定 目的:建立HPLC法同时测定马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷以及利用HPLC法同时测定马鞭草中木犀草素、芹菜素和山奈酚含量的方法,以控制该药材的质量。 方法:取马鞭草药材粉末约0.5 g,精密称定,加入20倍量80%甲醇,密塞,称定重量,超声处理45 min,放冷,称重,用80%甲醇补充减失的重量,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,进样测定。HPLC法测定马鞭草苷和戟叶马鞭草苷,采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm , 5μm) ,乙腈-水(15∶85)为流动相,检测波长为238 nm。HPLC法测定木犀草素、芹菜素和山奈酚,采用色谱柱DiamonsilTMC1(8250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.05%磷酸水(40∶60)为流动相,检测波长为350 nm,柱温为30℃。流速1.0 mL/min,进样量20μL。 结果:对于HPLC法马鞭草苷、戟叶马鞭草苷在17.2~155.2μg/mL和25.5~229.9μg/mL的浓度范围内与峰面积均呈良好的线性关系(r20.997);平均回收率分别为98.89%(RSD=1.1%)和99.00%(RSD=0.4%)。木犀草素、芹菜素和山奈酚三种组分的线性关系均良好(r20.995),平均回收率分别为98.14%(RSD=1.8%)、100.3%(RSD=1.5%)和97.12%(RSD=1.7%),精密度和重复性均良好。 结论:本研究采用HPLC法建立了同时测定马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷含量的方法,并利用HPLC法建立了马鞭草中木犀草素、芹菜素和山奈酚同时测定的方法,两种方法均有较高的专属性、灵敏度,具有较好的精密度和准确度,能够满足马鞭草药材质量控制的要求。 第三部分马鞭草提取物中黄酮类成分的药代动力学研究 目的:建立高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS-MS)测定大鼠血浆中木犀草素、山奈酚、芹菜素、槲皮素和异鼠李素浓度的方法,并研究5种黄酮在提取物单次给药后大鼠体内的药代动力学过程。 方法:大鼠以灌胃给予马鞭草提取物(10 mL/kg),分别于给药后5、15、30、60、90、120、150、180、240、360、480、720 min内眦动脉取血0.3 mL,置于肝素化塑料离心管中,样品预处理采用甲醇盐酸混合溶液沉淀蛋白后90°C水解30 min,离心,取上清液,利用HPLC-MS-MS内标法(SMZ),色谱柱为反相柱Waters SunFireTM C18(150mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水(0-2 min,45%-80%乙腈;2-5 min,80%乙腈; 5-5.1 min 80%-45%乙腈,v/v)梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,进样量20μL,分析时间为5 min。质谱条件:离子源为电喷雾离子化源(ESI);负离子方式检测;多反应监测模式(MRM);源喷射电压(IS)为-5000 V;雾化温度为650℃;雾化气(GS1,N2)压力为60 psi;辅助气(GS1,N2)压力为65 psi;气帘气(N2)压力为25 psi。各物质的MS和MS2离子碎片数据为木犀草素(285.0/133.0)、山奈酚(285.0/92.9)、芹菜素(269.0/117.0)、槲皮素(301.1/151.0)和异鼠李素(315.1/303.3)。 结果:血浆中木犀草素、山奈酚、芹菜素、槲皮素和异鼠李素的线性范围分别为0.005-2.50, 0.005-2.50, 0.020-10.0, 0.025-12.5和0.020-10.0μg/mL,定量下限分别为5、5、20、25和20 ng/mL,日内和日间精密度(RSD)在1.7%和10.8%之间,准确度(RE)在-8.3%和6.9%之间。提取回收率在81.5%和108.1%之间,基质效应在87.80%和107.6%之间。稳定性研究结果表明样品稳定。大鼠单次灌胃马鞭草提取物后,芹菜素的AUC及Cmax明显高于其它成分,药动学参数如下:T1/2分别为4.02±0.81,7.65±0.71、3.30±0.83、4.55±0.49和5.56±1.32 h , AUC0?t分别为6377.71±302.49,3624.10±248.08、25875.79±487.54、13442.09±787.12和2714.95±96.84 ngh/mL,AUC0?∞分别为10674.84±344.42,5140.93±852.06、28767.20±206.33、15806.8±265.17和3254.92±332.65 ngh/mL,MRT0?∞分别为9.67±3.88,12.75±1.43、5.95±0.57、5.06±1.03和7.09±1.53 h。 结论:建立了HPLC-MS-MS同时测定大鼠血浆中木犀草素、山奈酚、芹菜素、槲皮素和异鼠李素浓度的方法,并用于大鼠口服马鞭草提取物后5种黄酮类成分的药动学研究。该方法灵敏度高,分析时间短,具有良好的精密度和准确度,符合生物样品分析的要求。 第四部分HPLC法测定木犀草素和芹菜素的血浆蛋白结合率 目的:建立木犀草素和芹菜素在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白中蛋白结合率的测定方法,并计算不同种属血浆蛋白的相关参数。 方法:采用平衡透析法测定蛋白结合率,高效液相色谱法测定血浆中药物总浓度及游离的药物浓度。 结果:木犀草素的血浆蛋白结合率分别为:大鼠血浆:99.1±13.7%、99.2±12.4%和99.2±6.1%;人血浆:99.3±4.4%、99.4±8.3%和99.5±5.6%;牛血清白蛋白:97.7±10.2%、98.1±9.8%和89.6±5.0%。芹菜素的血浆蛋白结合率分别为:大鼠血浆:99.4±3.8%、99.6±5.6%和99.5±4.5%;人血浆:96.3±7.2%、97.9±10.5%和97.8±9.7%;牛血清白蛋白:98.7±8.6%、99.6±9.4%和99.1±8.0%。 结论:本文应用平衡透析法研究了木犀草素和芹菜素与人血浆蛋白,牛血清白蛋白和大鼠血浆蛋白的结合情况,结果表明木犀草素和芹菜素的血浆蛋白结合率较高,属高血浆蛋白结合率药物,并且不具有质量浓度依赖性,易引起具有药理作用的游离型血药质量浓度发生明显变化,提示木犀草素和芹菜素临床应用时应注意其安全性。


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